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摘要目的:<br>　　表没食子儿茶素表没食子酸酯((-)-Epigallocatechin-3-gallate，EGCG)是绿茶中含量最丰富的成份，前期研究报道，EGCG具有抗炎、抗氧化、抗肿瘤的作用，但其具体的作用机制还不明确。本研究旨在探讨EGCG抑制乳腺癌细胞迁移及炎症反应的分子机制，为EGCG的进一步开发及其在乳腺癌临床防治中的应用提供科学依据。<br>　　方法:<br>　　1.研究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响<br>　　用不同浓度的EGCG（5μM、10μM、20μM、50μM、100μM）分别处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7，分别在24h、48h、72h采用Alarmar blue染色法检测细胞活性，确定EGCG最适的作用浓度和时间。按照上述实验确定EGCG作用于乳腺癌细胞的合适浓度和时间，依次处理乳腺癌细胞MDA-MB-231和MCF-7，进行划痕和Transwell实验，进而探究EGCG对乳腺癌细胞迁移的影响。<br>　　2.EGCG影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达<br>　　EGCG处理乳腺癌细胞后，通过RT-qPCR和Western blot方法分别在mRNA水平和蛋白水平检测迁移相关基因E-cadherin、Vimentin的表达水平，同时检测肿瘤抑制基因SCUBE2的表达变化，分析SCUBE2与迁移相关基因表达的关系。<br>　　3.证明EGCG是通过影响SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移<br>　　首先，利用免疫组化技术，在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2的蛋白表达水平，确定SCUBE2与乳腺癌发生发展的关系;然后，构建SCUBE2基因的shRNA重组慢病毒载体，筛选得到干扰SCUBE2的稳转乳腺癌细胞系，检测干扰SCUBE2对E-cadherin和Vimentin基因表达的影响;最后，EGCG处理敲降SCUBE2的稳转细胞，采用划痕和Transwell实验检测其对细胞迁移的影响。<br>　　4.确定EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区DNA甲基化实现的<br>　　利用重亚硫酸盐处理及克隆测序的方法，在乳腺癌组织和癌旁组织中检测SCUBE2启动子区的DNA甲基化水平差异。EGCG处理乳腺癌细胞后，与对照组比较，分析SCUBE2基因启动子区甲基化程度的改变，同时通过RT-qPCR和Western blot检测E-cadherin和Vimentin基因的表达，证明EGCG能够影响SCUBE2启动子区DNA的甲基化，进而影响乳腺癌细胞迁移相关基因的表达。<br>　　5.探究EGCG对乳腺癌细胞炎症因子释放的影响<br>　　EGCG处理乳腺癌细胞后，通过ELISA试剂盒检测细胞因子IL-6和MCP-1的表达水平;此外，采用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后，再用含EGCG培养基培养，检测细胞因子的变化，分析参与EGCG抑制细胞因子释放的可能信号通路。<br>　　结果:<br>　　1.细胞活性检测结果显示，当EGCG浓度为20μM、作用时间达到24h时，乳腺癌细胞活力受到显著抑制(p＜0.05)，因此本研究随后以此条件开展实验。划痕和Transwell结果表明，EGCG能够显著抑制LPS诱导的乳腺癌细胞迁移(p＜0.01)。<br>　　2.EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用，伴随着迁移相关标志基因E-cadherin的上调和Vimentin的下调，此外，我们发现肿瘤抑制基因SCUBE2显著上调，由此我们推测SCUBE2基因可能与EGCG对乳腺癌细胞的抑制作用有关。<br>　　3.免疫组化结果显示，与癌旁组织相比，SCUBE2在乳腺癌组织中的表达明显降低，说明SCUBE2的低表达能够促进肿瘤的发生发展。干扰SCUBE2基因后，E-cadherin的表达下调，Vimentin的表达上调，说明SCUBE2在E-cadherin和Vimentin的上游对其进行调控。用EGCG处理干扰了SCUBE2的稳转细胞系后，我们发现EGCG的抑制作用减弱，证明EGCG是通过上调SCUBE2基因的表达进而抑制乳腺癌细胞迁移。<br>　　4.SCUBE2启动子区的DNA甲基化程度在乳腺癌组织中显著高于癌旁组织(p＜0.05)，这与基因表达检测结果一致。EGCG处理乳腺癌细胞后，检测SCUBE2的甲基化变化，结果显示EGCG可以显著降低SCUBE2的甲基化比率(p＜0.05)，由此说明EGCG对SCUBE2表达水平的调节是通过影响其启动子区甲基化实现的。<br>　　5.ELISA结果显示，EGCG处理能够显著抑制炎症相关因子(IL-6和MCP-1)的表达。用STAT3信号通路抑制剂S3I-201预处理细胞后，再用EGCG处理，我们发现EGCG对炎症相关因子表达的调控作用与单独S3I-201处理组相比变化不显著，因此，我们推测EGCG可能通过STAT3信号通路来调控乳腺癌相关炎症因子的表达。<br>　　结论:<br>　　EGCG通过影响SCUBE2启动子区的甲基化水平来实现对其表达的调控，SCUBE2进而通过调节迁移相关基因（E-cadherin和Vimentin）的表达，最终抑制乳腺癌细胞迁移。此外，EGCG可能通过STAT3信号通路来抑制的乳腺癌相关炎症因子的表达。