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摘要本实验以分离自新鲜苜蓿样品且抑菌活性良好的8株乳酸菌为供试菌株，考察其在不同碳源中发酵产酸的性能，结合苜蓿青贮实验，筛选优良乳酸菌作为出发菌株，通过N+注入诱变选育纤维降解能力提高的突变菌株，并对筛选体系进行了优化。研究了出发菌株及突变菌株在苜蓿青贮过程中对青贮品质的影响，及诱变前后菌株纤维降解相关的3个酶基因表达量的变化。<br>　　将实验室保存的8株分离自山西省新鲜苜蓿样品的抑菌活性良好的乳酸菌作为供试菌株，进行发酵苜蓿粉实验。发酵48h后，添加A340，A344，A345和A357的处理组的pH降至最低(pH＜5.20)。将8株乳酸菌分别接种于1％的葡萄糖、纤维二糖、葡聚糖(MW:3000)和微晶纤维素(MCC)溶液，其中菌株A345在4种碳源溶液中产酸性能均最强。通过生理生化及碳源发酵指标鉴定，结合16S rRNA序列分析，菌株A345被鉴定为植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）。<br>　　将菌株A345用于苜蓿青贮实验。青贮65d后，菌株A345比商业菌株FG1表现出更好的性能。添加菌株A345的青贮饲料的pH最低（pH为4.67），乳酸和乙酸含量最高，分别为62.44g/kg DM-1和26.56g/kg DM-1。添加菌株A345的青贮饲料的氨态氮含量和大肠杆菌数量也显著低于添加FG1的青贮饲料(P＜0.05)。主成分分析结果表明，添加菌株A345的青贮效果受苜蓿品种的影响。与品种三得利相比，劲能的自然青贮效果较差，然而该品种在添加菌株A345青贮后，氨态氮和乙酸含量，以及乳酸菌、大肠杆菌和芽孢杆菌的计数均较低(P＜0.05)。表明菌株A345作为添加剂能够显著改善苜蓿青贮品质，尤其适用于自然青贮效果不好的苜蓿品种。通过实时定量荧光PCR(qPCR)分析与纤维降解相关的3个酶基因的表达量，结果表明，菌株A345的6-磷酸-β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶E样蛋白质、N-乙酰-葡糖胺转移酶基因表达量均显著高于商业菌株FG1，且菌株A345的纤维降解能力或许能被羧甲基纤维素钠诱导。<br>　　以A345为出发菌株进行N+注入。在注入1×1015N+·cm-2剂量下，菌株致死率为70.44％,在5×1015N+·cm-2和1×1016N+·cm-2剂量下，辐照致死率无显著差异，均达到90％以上。利用刚果红染色法测定菌株纤维降解性能。第一轮诱变后筛选出刚果红染色水解圈较大的突变菌株Ei-177，并以其为出发菌株进行第二轮N+注入。第二轮诱变后筛选出水解圈增大的突变菌株zw1-33，zw2-8，zw2-21，zw2-23，zw3-57。对5株突变菌株进行发酵苜蓿粉实验及CMC酶活测定。结果表明zw2-21在发酵苜蓿粉48h后pH较低且CMC酶活最高。<br>　　设置多个处理组（添加A345，添加zw2-21，添加商业菌株FG1，添加商业菌株YX）进行苜蓿青贮实验。通过一般线性模型分析显示，添加zw2-21的处理组pH最低，降至5.15(P＜0.05)。添加A345及其突变菌株zw2-21均能有效抑制大肠杆菌的生长。同时，添加zw2-21的处理组乳酸及乙酸含量均显著高于添加出发菌株A345的处理组(P＜0.05)。<br>　　以A345为出发菌株，进行剂量为1×1014N+·cm-2，5×1014N+·cm-2，1×1015N+·cm-2，5×1015N+·cm-2，1×1016N+·cm-2的N+注入。在注入1×1014N+·cm-2和5×1014N+·cm-2的剂量下，菌株致死率无显著差异，均不超过40％。另外三种剂量下致死率与之前实验一致。对刚果红染色法进行优化，提高筛选效率，从1000株突变菌株中筛选出60株刚果红染色水解圈明显增大的突变菌株。通过发酵葡聚糖(MW:3000)实验、发酵苜蓿粉实验及遗传稳定性实验，最终筛选得到3株纤维降解能力提高且具有遗传稳定性的突变菌株。其中，F-54在发酵葡聚糖实验中pH最低，发酵苜蓿粉48h后pH最低（P＞0.05）且乳酸含量最高(P＜0.05)。qPCR分析结果表明，F-54的6-磷酸-β-葡糖苷酶、内切葡聚糖酶E样蛋白质、N-乙酰-葡糖胺转移酶基因表达量分别达到A345的5.87，4.62和5.49倍。抑菌实验结果显示诱变前后菌株对大肠杆菌、沙门氏菌和李斯特菌的抑菌活性均无显著差别。<br>　　本实验建立了一套高效快速的具有较高纤维降解能力突变乳酸菌的筛选体系，并筛选得到3株具有遗传稳定性的优良菌株。苜蓿青贮实验结果表明，将具有较高纤维降解能力的乳酸菌作为添加剂，有利于提升苜蓿青贮发酵品质。同时，利用qPCR对纤维降解相关酶基因表达量进行了分析，在转录水平解释了诱变前后菌株纤维降解能力的差异，初步在分子水平上阐明了突变菌株的变异机理。