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摘要本文主要从以下几方面进行论述：<br>　　第一部分 RSK4真核表达载体对乳腺癌细胞MD-MB-231及T47D侵袭转移的影响<br>　　目的:通过人RSK4基因真核表达载体，转染乳腺癌细胞MD-MB-231和T47D，观察过表达RSK4基因对乳腺癌细胞生物学行为的影响。<br>　　方法:通过脂质体2000介导法瞬时转染pcDNA3.1/Neo空白载体(MN10，MN11，TN1和TN2表示)和pcDNA3.1/Neo-RSK4至人乳腺癌细胞MD-MB-231(MR11，MR12和MR19表示)和T47D(TR1和TR2表示)细胞株。应用RT-PCR检测转染后各组RSK4-mRNA表达情况;Western blot检测各组RSK4蛋白的表达以及转染RSK4后MD-MB-231细胞中CyclinA，D1，E、P21、pRb、RbAP46和p44/42MAPK蛋白表达情况情况;使用WB和siRNA干扰技术检测CLDN2和CXCR4蛋白的表达情况;应用软琼脂糖克隆形成试验、细胞迁袭试验、划痕试验以及趋化试验检测其侵袭转移情况;MTT法检测细胞增殖;流式细胞仪分析各组细胞周期和凋亡。<br>　　结果:pcDNA3.1/Neo-RSK4真核表达载体，在瞬时转染48h的MD-MB-231组细胞中检测到较高水平RSK4基因的mRNA和蛋白表达。与空白载体组(MN10，MN11，TN1和TN2)比较:MR11，MR12组RSK4的高表达可以上调p21、RbAp46、cyclinD1和磷酸化的Rb蛋白，同时与CyclinA、CyclinE和p44/42MAPK蛋白表达无关;高表达RSK4可以上调CLND2蛋白表达而抑制CXCR4蛋白的表达;软琼脂糖克隆形成试验提示MR11，MR12，TR1和TR2组在转染3周时细胞生长受到明显抑制;Transwell细胞迁袭试验和划痕试验显示MR11，MR12组明显抑制细胞迁徙;趋化试验显示MR11，MR12组可以抑制CXCL12诱导的趋化作用;MTT法结果显示在MR11，MR12组细胞增殖明显受到抑制;流式细胞仪结果显示在10％的FBS血清培养条件下(10％ FBS，P=0.038;5％ FBS，P=0.042)MR11和MR12组细胞周期G0-G1期比例上升，在加入20％的5-脱氧-5-氟尿苷(5’-dFUR)培养条件下(10μmol/L，P=0.037;20μmol/L，P=0.029; and30μmol/L，P=0.022)MR11和MR12组细胞S期比例上升。<br>　　结论:过表达RSK4基因明显抑制乳腺癌细胞的生长、侵袭和转移，提示RSK4参与乳腺癌细胞的侵袭转移调控。<br>　　第二部分 RSK4过表达稳定乳腺癌细胞株对裸鼠人乳腺癌移植瘤体内侵袭和转移的影响<br>　　目的:筛选稳定过表达RSK4基因的乳腺癌细胞株，检测细胞功能的改变;构建裸鼠的人乳腺癌MD-MB-231细胞移植瘤模型，观察过表达RSK4基因对乳腺癌体内成瘤的影响。<br>　　方法:将pcDNA3.1/Neo和pcDNA3.1/Neo-RSK4分别转染进人乳腺癌细胞MD-MB-231，通过筛选出稳定的细胞株，命名为空载体组(MN10，MN11)和转染组(MR11，MR12)。建立裸鼠人乳腺癌MD-MB-231细胞移植瘤模型，观察移植瘤的生长、侵袭转移的情况;以免疫组化及HE染色观察各组标本中肿瘤生长和转移情况。<br>　　结果:成功筛选出稳定表达的乳腺癌细胞株MR11和MR12和空白对照组MN10和MN11;构建裸鼠的人乳腺癌移植瘤模型，解剖裸鼠发现:注射MR11或MR12细胞的裸鼠在所形成的肿瘤大小和重量上明显小于MN10和MN11对照组;RSK4高表达的MR11和MR12组有40％的裸鼠发生转移瘤的形成，而对照组有80％的裸鼠出现转移瘤，其中发生在肺的转移灶MN10和MN11组明显多于MR11和MR12组。<br>　　结论:成功构建裸鼠人乳腺癌MD-MB-231细胞转移瘤模型，较真实模拟人乳腺癌生长过程，证实过表RSK4基因在体内可抑制乳腺癌生长。<br>　　第三部分 RSK4-mRNA的剪切变体与乳腺癌的初步研究<br>　　目的:通过对RSK4结构深入研究，发现RSK4的可变剪切体初步探讨它们的功能。<br>　　方法:我们通过5' Race、TOPO克隆以及DNA测序等方法在乳腺癌细胞株中重新克隆了RSK4的5’-氨基端，通过计算机分析与NCBI数据库中人及鼠的序列进行比较(NM014496，NM025949);在克隆乳腺细胞株RSK4-cDNA时，利用表达序列标签(EST)数据库和外显子间隔芯片(exon junction array)数据库，利用生物信息学方法，验证了RSK4的前体RNA(pre-mRNA)在剪切成为成熟的mRNA的时候具有两个可变的剪切位点，并在乳腺癌和胰腺癌细胞株中验证它们的存在。<br>　　结果:全长的RSK4 cDNA在老鼠中共有25个外显子，在人类中有26个外显子。我们发现NCBI数据库所提供RSK4-cDNA的5’-氨基端序列不全，并存在着不同的起始密码ATG。鼠源性RSK4(NM_025949)第一个起始密码ATGα较人源性RSK4(NM014496)起始密码ATGβ多了288个核苷酸（96个氨基酸）;我们发现在人类和鼠RSK4的前体mRNA(pre-mRNA)在剪切成为成熟的mRNA的时候具有两个可变的剪切位点，第一个位点是鼠22外显子(E22)，人23外显子(E23)起始部分的15个碱基的缺失，这样导致RSK4蛋白在翻译时候开放阅读框少了5个氨基酸;第二个位点是鼠第24个外显子(E24)，人第25外显子(E25)整个缺失，这样导致蛋白质在翻译的时候开放阅读框缺少了44或者47个氨基酸。在人类中这两个可变的剪切位点随机组合可以形成四种可变的RSK4变异体，即-15nt+E24/E25,-15nt-E24/E25,+15nt-E24/E25,+15nt+E24/E25(thewild type)，在鼠类中因为存在着2～3起始密码ATG，所以可以形成8或者16个RSK4变异体，并初步了解它们的功能。<br>　　结论:RSK4存在剪切变体，可能在特定的情况下转录不同的亚型来精确调控乳腺癌细胞的生长和凋亡的机制。<br>　　第四部分 RSK4在人乳腺癌组织表达以及与侵袭转移相关基因LOX、MMP-2及MMP-9相关性研究<br>　　目的：研究RSK4在人乳腺癌中的表达，明确其与乳腺癌临床预后指标的关系，分析RSK4与LOX、MMP-2、MMP-9在乳腺癌组织中的相关性。<br>　　方法：采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)法检测RSK4-mRNA在56例乳腺癌组织、56例正常乳腺组织及20例乳腺良性病变组织中的表达状况。采用免疫组化(S-P)法检测56例乳腺癌组织、56例正常乳腺组织及20例乳腺良性病变组织中RSK4、LOX、MMP-2及MMP-9的表达情况。<br>　　结果：RSK4-mRNA在乳腺癌组织中的阳性表达率为48.21％例(27/56)，在乳腺良性病变组织中的表达率75.00％(15/20)，在正常乳腺组织中的表达率为76.67％(43/56)，统计学分析显示，RSK4-mRNA在乳腺癌组织中的表达率明显低于正常乳腺组织和乳腺良性病变组织，差异有显著性意义(P＜0.05);RSK4-mRNA的表达率与肿瘤大小及临床分期有关，肿瘤越大、临床分期越晚，RSK4-mRNA的表达率越低(P＜0.05);而与年龄、淋巴结转移无关（P＞0.05）;RSK4蛋白在乳腺癌组织中的阳性表达率为39.29％(22/56)，明显低于其在正常乳腺组织中的表达(71.43％)，及乳腺良性病变组织中的表达(70.00％)，差异具有统计学意义(P＜0.05);RSK4蛋白的表达与肿瘤大小、临床分期、淋巴结转移相关(P＜0.05)，肿瘤越大、临床分期越晚，以及伴淋巴结转移者，RSK4-mRNA的表达率越低(P＜0.05);而与年龄、ER、PR和Her-2无相关性(P＞0.05)。56例乳腺癌组织中，RSK4-mRNA和RSK4蛋白两者表达一致率为73.21％(41/56);RSK4蛋白阳性表达乳腺癌，RSK4-mRNA表达率为77.27％(17/22)，RSK4蛋白表达阴性乳腺癌，RSK4-mRNA阴性表达率为70.59％(24/34)，统计学分析有显著相关（χ2=10.254，P＜0.05）。乳腺癌RSK4蛋白与LOX、MMP-2及MMP-9无相关性(P＞0.05)。<br>　　结论：RSK4作为乳腺癌的抑癌基因抑制乳腺癌进展侵袭及转移;RSK4蛋白表达与LOX、MMP-2和MMP-9表达不相关，RSK4抑制肿瘤侵袭转移可能不是通过调控LOX，MMP-2及MMP-9通路来实现。