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摘要卵巢癌是女性生殖系统三大恶性肿瘤之一，病死率位居妇科恶性肿瘤之首。据美国最新统计数据显示，2018年美国新发卵巢癌22，240例，相关死亡病例数约14，070人，5年生存率约47％。近半个世纪卵巢癌诊治未取得明显进展，主要原因在于卵巢癌起源不明与发病机制不清。卵巢癌为高度异质性恶性肿瘤，绝大多数卵巢癌为上皮性浆液性癌，占整个卵巢癌的60-80％。基于一系列的形态学和分子遗传学研究，2004年美国霍普金斯大学Kurman教授提出二元模型理论将不同类型的卵巢上皮性癌分为两型:Ⅰ型和Ⅱ型。根据此模型，卵巢浆液性癌分为“高级别浆液性癌”和“低级别浆液性癌”两种类型。<br>　　传统理论认为卵巢浆液性癌是一种恶性上皮性肿瘤，来源于卵巢本身，即源于卵巢表面上皮或皮质包涵体囊肿，但在卵巢中并未发现明确的浆液性癌早期病变。在1990年代末和2000年代初，对有家族史或遗传性BRCA1/BRCA2突变的卵巢癌高危人群进行预防性输卵管-卵巢切除，并由病理专家进行精细的输卵管和卵巢切片。他们发现在输卵管有隐藏的非浸润性和浸润性肿瘤，尤其是在伞端，而卵巢内无病变。随后，一项盆腔高级别浆液性癌的研究显示，无卵巢癌高风险及BRCA突变的癌症患者中48％存在输卵管上皮内癌。因此，学者们开始对卵巢高级别浆液性癌的经典起源理论提出质疑。近年来，一系列的组织学和分子学研究证据表明大部分的卵巢高级别浆液性癌来源于输卵管，尤其是浆液性输卵管上皮内癌，继而累及卵巢和腹膜。首先，在高级别浆液性癌患者的输卵管存在非浸润性和浸润性肿瘤，尤其是在输卵管伞;第二，浆液性输卵管上皮内癌具有与高级别浆液性癌一致性的TP53突变，提示两者之间克隆性相关;第三，高级别浆液性癌基因表达模式与正常输卵管上皮相似，而非卵巢上皮;最后，通过输卵管分泌上皮细胞成功构建高级别浆液性癌动物模型进一步证实输卵管分泌细胞是高级别浆液性癌的细胞来源。综上，大部分的高级别浆液性癌来源于输卵管。<br>　　与高级别浆液性癌相比，目前低级别浆液性癌起源仍不明确，有限的低级别浆液性癌病例是研究面临的主要困难。形态学和分子学的证据表明卵巢低级别浆液性癌的发生是一个缓慢、逐步发展的过程，从卵巢上皮性包涵体囊肿到浆液性囊腺瘤，再到浆液性交界性肿瘤，最终发展为低级别浆液性癌。传统理论认为卵巢上皮性包涵体由卵巢表面上皮内陷经过输卵管上皮化生形成，但临床病理中罕见卵巢表面上皮与苗勒管样上皮移行或混合型的卵巢上皮性包涵体，因此项目组前期对卵巢低级别浆液性癌和上皮性包涵体的来源提出质疑，推测大部分卵巢低级别浆液性癌可能来源于输卵管。前期的研究结果表明大部分卵巢上皮性包涵体(78％)免疫表型与输卵管一致（calterinin-/PAX8+），提示大部分的卵巢上皮性包涵体和低级别浆液性癌可能来源于输卵管上皮。此外，Kurman研究发现乳头样输卵管增生是卵巢浆液性交界性肿瘤的前期病变。同时，Laury通过形态学和免疫化学研究表明浆液性交界性肿瘤中纤毛细胞和分泌细胞共存，类似于正常的输卵管上皮。而且分泌细胞过度生长在交界性肿瘤的输卵管上皮较正常对照人群输卵管上皮更常见。上述研究均从形态学和免疫学研究表明低级别浆液性癌很可能来源于输卵管上皮，但目前对低级别浆液性癌起源尚无分子学的研究。因此，我们对低级别浆液性、浆液性交界性肿瘤、高级别浆液性癌、输卵管上皮、卵巢表面上皮和腹膜间皮6组样本进行了基因表达谱分析，进一步从分子水平研究低级别浆液性癌起源。该研究将对低级别浆液性癌的预防和治疗具有重大意义。<br>　　尽管大量研究表明大部分的卵巢高低级别浆液性癌均来源于输卵管上皮，但他们是两种完全不同的肿瘤，而非同一种肿瘤的不同分级，两者具有截然不同的临床病理特征和分子学特征。高级别浆液性癌对铂类为基础的化疗较敏感，但5年生存率极低。低级别浆液性癌生长缓慢，5年生存率相对较高，但通常对标准化疗不敏感。由于卵巢癌缺乏有效的早期诊断技术，70％确诊时已为晚期，部分患者需进行新辅助化疗。此外，靶向特定分子改变的临床试验在持续进行，如靶向MAPK通路治疗低级别浆液性癌。因此，对二者准确的鉴别诊断对于妇科肿瘤专家的治疗决定是至关重要的，有助于获得最佳的治疗效果，降低不必要的死亡。<br>　　目前浆液性卵巢癌的二分级系统主要基于核的异形性和有丝分裂指数，该系统易于掌握且可重复性较好。但病理专家对核异形性和有丝分裂指数的主观评价给二者鉴别诊断带来难题，而且盆腔穿刺活组织检查时有限的组织标本也给二者的鉴别诊断造成障碍。因此，我们进行相关研究探索有效的分子标记，建立客观标准，辅助卵巢高低级别浆液性癌鉴别诊断，实现高效靶向治疗，提高卵巢癌生存率。<br>　　本课题研究内容主要分为以下两个部分:<br>　　第一部分 卵巢低级别浆液性癌起源研究<br>　　目的:卵巢癌为高度异质性肿瘤，其中浆液性癌占卵巢癌的大部分。Kurman教授提出的卵巢癌二元模型将卵巢浆液性癌分为“高级别浆液性癌”和“低级别浆液性癌”两种类型。传统理论认为浆液性癌是一种上皮性恶性肿瘤，来源于卵巢表面上皮。目前，越来越多的证据表明:大部分的卵巢高级别浆液性癌来源于输卵管上皮细胞，而低级别浆液性癌的细胞起源仍未明。我们最近通过病理形态和免疫表型的研究发现大部分的低级别浆液性癌也可能来源于输卵管。目前对于低级别浆液性癌的细胞起源尚无分子学的证据，因此我们在本研究中分析比较卵巢低级别浆液性癌、浆液性交界性肿瘤、输卵管上皮、卵巢表面上皮和腹膜间皮mRNA表达谱，并以高级别浆液性癌作为阳性对照，从分子水平探讨卵巢低级别浆液性癌的细胞起源。<br>　　材料和方法:收集山东大学齐鲁医院自2014年至2015年期间31例组织样本，包括6例卵巢低级别浆液性癌组织、6例浆液性交界性肿瘤组织、5例正常输卵管上皮组织、4例正常卵巢表面上皮组织和4例正常腹膜间皮组织，6例卵巢高级别浆液性癌组织作为阳性对照。RNA-seq检测31例组织样本mRNA表达。Kruskal-Wallis分析6组样本差异表达基因，并进行非监督分层聚类验证样本的质量及分析6组样本的整体相似性。基于3组正常样本差异表达基因进行非监督聚类，明确卵巢低级别浆液性癌的起源。然后，应用秩和检验及皮尔森相关性检验进一步分析卵巢低级别浆液性癌与正常组织的相关性。基于基因表达分析结果，选取明显差异表达分子（PAX8、CDH1、FOXA2和ARX）采用qRT-PCR和免疫组织化学方法在卵巢浆液性肿瘤组织、输卵管上皮组织、卵巢表面上皮组织和腹膜间皮组织中进行验证。<br>　　结果:非监督聚类系统树图显示卵巢表面上皮与腹膜间皮聚集，而卵巢浆液性肿瘤，包括低级别浆液性癌、浆液性交界性肿瘤和高级别浆液性癌与输卵管上皮聚集。而且，与卵巢表面上皮和腹膜间皮相比，低级别浆液性癌与输卵管上皮关系更密切。PAX8、CDH1、FOXA2和FOLR1的mRNA表达水平在浆液性肿瘤和输卵管上皮中明显高于卵巢表面上皮和腹膜间皮，而ARX和FCN1的mRNA表达在卵巢表面上皮和腹膜间皮明显高于浆液性肿瘤和输卵管上皮。免疫组化分析显示PAX8、CDH1和FOXA2明显特异性表达于浆液性肿瘤和输卵管上皮而非卵巢表面上皮。与此相反，ARX则主要表达于卵巢表面上皮而非输卵管上皮和浆液性肿瘤。<br>　　结论:本研究结果从分子水平提供证据进一步表明输卵管很可能是低级别浆液性癌的细胞来源。该结果为卵巢癌预防提供新的策略，有助于卵巢癌早期检测及新的治疗方案实施。<br>　　第二部分 卵巢低级别浆液性癌分子诊断研究<br>　　目的:卵巢高级别浆液性癌和低级别浆液性癌是两种完全不同的肿瘤，具有截然不同的发生机制和临床生物学特征。二者对相同的治疗方案反应不同，具有不同的预后。因此，临床处理前对二者准确的鉴别诊断至关重要。由于盆腔穿刺活组织检查时获取的组织标本有限，对二者的鉴别提出巨大挑战。本研究旨在探索有效的分子标记以进行高低级别浆液性癌鉴别诊断。<br>　　材料和方法:收集山东大学齐鲁医院自2014年至2015年期间12例组织样本，包括6例卵巢低级别浆液性癌组织和6例卵巢高级别浆液性癌组织。RNA-seq检测12例组织样本mRNA表达，DESeq比较分析两组样本差异表达基因。基于两组样本差异表达基因进行非监督聚类，并扩大样本采用qRT-PCR方法验证两组样本间明显差异表达分子（LAMP3、EGFL6、CDKN 1A和AGR3）。免疫组织化学进一步分析145例高级别浆液性癌和30例低级别浆液性癌TP53及AGR3表达。<br>　　结果:非监督聚类系统树图显示高低级别浆液性癌间699个明显差异表达基因（＞2倍差异）将二者明显区分开。qRT-PCR和免疫印迹分析发现AGR3在低级别浆液性癌中表达明显高于高级别浆液性癌。免疫组织化学研究显示高级别浆液性癌中87.6％(127/145)存在TP53异常表达（0或≥75％阳性表达），低级别浆液性癌中仅为13.3％(4/30)。然而，AGR3阳性染色诊断低级别浆液性癌的敏感性和特异性分别为80.0％(24/30)和89.7％(130/145)。TP53和AGR3均能有效的区分高低级别浆液性癌（P值均小于0.001）。ROC曲线分析显示AGR3曲线下面积(0.848)与TP53 (0.871)相似。联合TP53和AGR3（TP53野生模式和AGR3阳性）进行鉴别诊断的准确性可高达93.1％(163/175)。<br>　　结论:在常规组织病理学诊断的基础上联合应用TP53和AGR3可明显完善高低级别浆液性癌的鉴别诊断。而且，有助于临床治疗的选择，降低卵巢癌整体死亡风险。