TGF-β信号通路相关基因FBXO32、SMAD4、PAI-1和VEGF与FOXC2在结直肠癌发病中作用机制的研究-论文-万方医学网

TGF-β信号通路相关基因FBXO32、SMAD4、PAI-1和VEGF与FOXC2在结直肠癌发病中作用机制的研究

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摘要肿瘤的发生和进展是多因素、多步骤、多途径、多基因的相对复杂的一系列过程，一旦肿瘤出现转移或复发，往往预后不理想。随着对结直肠癌发生的相关基因及信号通路研究的不断深入，发现很多与之相关的因子，例如micRNA、lncRNA、E-Cadherin、VEGF、MMP等在结直肠癌的发生及进展过程中都起着重要作用。 　　TGF-β信号通路在结直肠癌的发生及进展过程中起着至关重要的作用，然而，其相关基因fbxo32、smad4、pai-1和vegf与foxc2在结直肠癌发生和进展中的作用研究较少。其中，foxc2是一种癌基因，研究表明其与多种肿瘤的发生发展有关，如胃癌、食管癌、卵巢癌、乳腺癌等，但在结直肠癌中的作用需要进行深入研究、探讨和验证。 　　通过三部分实验对TGF-β信号通路相关基因fbxo32、smad4、pai-1、vegf和foxc2在结直肠癌中的作用进行研究。第一，采用免疫组化法分析FBXO32及Smad4在结直肠癌组织和正常结直肠粘膜组织中的表达;采用实时荧光定量PCR及蛋白印迹法检测FBXO32、Smad4在大肠癌细胞系与人结肠粘膜上皮细胞中的表达;对结直肠癌患者临床病理资料进行分析，评估其表达与临床病理资料的关系;通过生存分析评估其表达情况对患者预后的影响。第二采用实时荧光定量PCR及蛋白印迹法检测PAI-1及VEGF在大肠癌细胞系与人结肠粘膜上皮细胞中的表达，初步探讨其与大肠癌发生发展可能的分子机制。第三，采用免疫组化法分析FOXC2在结直肠癌组织及正常结直肠粘膜组织中的表达;利用实时荧光定量PCR及蛋白印迹法检测FOXC2在结直肠癌组织及正常结直肠粘膜组织中的表达;对结直肠癌患者的临床病理资料进行分析，评估其表达与临床病理资料的关系。 　　第一部分 FBXO32和Smad4参与结直肠癌发病的作用及机制研究 　　目的： 　　(1)通过检测FBXO32和Smad4在结直肠癌组织和正常结肠粘膜组织中的表达情况评估其与结直肠癌临床病理资料之间的关系; 　　(2)通过分析FBXO32和Smad4在结直肠癌组织中的表达情况与患者预后的关系，评估FBXO32和Smad4对患者预后的影响; 　　(3)通过检测FBXO32与Smad4在大肠癌细胞系及人正常大肠粘膜上皮细胞中的表达情况，探究其在大肠癌发生发展中的作用和机制; 　　(4)通过FBXO32和Smad4在结直肠癌组织和细胞中的表达情况，分析fbxo32基因在结直肠癌中作用的信号通路，进一步探讨TGF-β/Smad4信号通路作用的靶基因。 　　方法： 　　(1)搜集结直肠癌组织标本122例及正常结直肠粘膜组织标本43例，以上样本均经过两名以上高年资病理科医生确认，利用免疫组织化学-SP法检测FBXO32及Smad4的表达情况，进一步分析FBXO32和Smad4表达结果的差异; 　　(2)根据结直肠癌患者的临床病理资料分析FBXO32与患者年龄、性别、肿瘤分期、分化程度及远处转移的关系; 　　(3)利用Kaplan-Meier对FBXO32低表达组及高表达组进行生存分析，观察5年生存时间的差异; 　　(4)对大肠癌细胞株HT-29、HCT-116和Caco-2及人正常大肠粘膜上皮细胞株NCM-460进行培养，并提取细胞mRNA和蛋白; 　　(5)采用Real-time PCR(RT-PCR)方法检测大肠癌细胞株HT-29、HCT-116和Caco-2及人正常大肠粘膜细胞株NCM-460mRNA的fbxo32和smad4表达情况; 　　(6)利用蛋白印迹即Western blot方法检测大肠癌细胞株HT-29、HCT-116和Caco-2及人正常大肠粘膜上皮细胞株NCM-460蛋白的FBXO32、Smad4表达情况。 　　结果： 　　(1)经过免疫组化-SP法染色后发现，在122例结直肠癌组织中，有28例FBXO32表达阳性，阳性率仅为22.95％，43例正常结直肠粘膜组织中有31例表达阳性，阳性率高达72.09％; 　　(2)临床病理特征相关性分析结果表明，FBXO32与结直肠癌的肿瘤分期、分化程度及淋巴结转移显著相关(p＜0.05);但FBXO32的表达水平与年龄、性别无明显相关性(p＞0.05)。Smad4与结直肠癌的分化程度及淋巴结转移显著相关(p＜0.05);但Smad4与年龄、性别及肿瘤分期无明显的相关性(p＞0.05); 　　(3)RT-PCR结果证实大肠癌细胞株HT-29、HCT-116和Caco-2中fbxo32与smad4的表达情况较人正常大肠粘膜上皮细胞NCM460明显降低，差异具有统计学意义(p＜0.05); 　　(4)Western blot结果表明，FBXO32和Smad4在大肠癌细胞株HT-29、HCT-116和Caco-2中表达显著低于正常大肠粘膜上皮细胞株NCM-460，差异具有统计学意义(p＜0.05); 　　(5)生存分析显示FBXO32高表达组的患者整体生存期要明显高于FBXO32低表达组，差异具有统计学意义(p＜0.05)。 　　结论： 　　综上所述，fbxo32可能是TGF-β/Smad4信号通路的靶基因，其在结直肠癌组织中低表达，并且与结直肠癌患者的临床分期、淋巴结转移及分化程度均有相关性。结直肠癌患者FBXO32高表达者生存期更长。因此，fbxo32可能作为预测结直肠癌恶性程度的靶基因，有助于复发高危患者的筛查及个体化治疗方案的制定。 　　第二部分 PAI-1与VEGF在大肠癌细胞株中的表达分析 　　目的： 　　通过检测PAI-1和VEGF在大肠癌细胞系及人正常大肠粘膜上皮细胞中的表达情况，探究其在大肠癌发病中的潜在作用。 　　方法： 　　(1)对大肠癌细胞株HT-29、HCT-116和Caco-2及人正常大肠粘膜上皮细胞株NCM-460进行培养，并提取细胞mRNA和蛋白; 　　(2)采用RT-PCR方法检测大肠癌细胞株HT-29、HCT-116和Caco-2及人正常大肠粘膜上皮细胞株NCM-460 mRNA的pai-1和vegf表达情况; 　　(3)利用蛋白印迹即Western blot方法检测大肠癌细胞株HT-29、HCT-116和Caco-2及人正常大肠粘膜细胞株NCM-460蛋白的PAI-1和VEGF表达情况。 　　结果： 　　(1)RT-PCR结果证实在大肠癌细胞株HT-29、HCT-116和Caco-2中pai-1表达较人正常大肠粘膜上皮细胞株NCM460明显降低，差异具有统计学意义(p＜0.05);vegf在三个大肠癌细胞株中的表达情况显示，HT-29及Caco-2较人正常大肠粘膜上皮细胞株NCM460明显升高，差异具有统计学意义(p＜0.05)，HCT-116较人正常大肠粘膜上皮细胞株NCM460亦升高，差异没有统计学意义(p＞0.05); 　　(2) Western blot结果表明PAI-1在大肠癌细胞株HT-29、HCT-116和Caco-2中表达显著低于人正常大肠粘膜上皮细胞株NCM-460，差异具有统计学意义(p＜ 0.05);VEGF在三种大肠癌细胞株中表达均高于人肠上皮细胞株NCM460，差异具有统计学意义(p＜0.05)。 　　结论： 　　PAI-1在大肠癌细胞株中呈低表达，VEGF在大肠癌细胞株中呈高表达，对于大肠癌的检测及预后具有指导意义。 　　第三部分 FOXC2在结直肠癌中的表达及其与临床病理关系的研究 　　目的： 　　通过检测FOXC2在结直肠癌组织及癌旁正常组织中的表达情况，并分析其与临床病理资料之间的关系，探究其在结直肠癌发生和进展中的作用。 　　方法： 　　(1)收集新鲜结直肠癌组织83例及癌旁正常组织83例，以上样本均经过两名以上高年资病理科医生确认，利用免疫组织化学-SP法检测FOXC2的表达情况; 　　(2)提取新鲜结直肠癌组织及癌旁正常组织的mRNA和蛋白; 　　(3)采用Real-time PCR (RT-PCR)方法检测83例结直肠癌组织及83例癌旁正常组织中foxc2的表达情况; 　　(4)利用蛋白印迹即Western blot方法测83例结直肠癌组织及83例癌旁正常组织中FOXC2的表达情况。 　　结果： 　　(1)FOXC2在83例结直肠癌组织中45例呈高表达，阳性率为54.22％，83例癌旁正常组织中10例高表达，阳性率为12.05％; 　　(2)FOXC2与结直肠癌的临床分期、分化程度及Ki67表达具有显著相关性(p＜0.05);但FOXC2表达水平与年龄、性别及淋巴结转移无明显相关性(p＞0.05); 　　(3)RT-PCR检测结果证实foxc2在结直肠癌患者组织标本中的表达较癌旁正常组织明显升高，差异具有统计学意义(p＜0.05); 　　(4)Western blot结果显示，FOXC2在结直肠癌组织中表达较癌旁正常组织表达高，差异具有统计学意义(p＜0.05)。 　　结论： 　　FOXC2在结直肠癌中呈高表达，其表达情况与肿瘤的分期、分化程度等具有相关性，因此，foxc2可能与结直肠癌的发生及恶性进展有关，它可能作为预测结直肠癌恶性程度的分子靶基因，有助于复发高危患者的筛查，个性化的治疗方案的制定。