糖尿病及血管新生因子对动脉粥样硬化斑块不稳定性的影响及作用机制-论文-万方医学网

首页 > 山东大学 > 糖尿病及血管新生因子对动脉粥样硬化斑块不稳定性的影响及作用机制

糖尿病及血管新生因子对动脉粥样硬化斑块不稳定性的影响及作用机制

二维码有效期 120s

收藏纠错

摘要世界卫生组织（World Health Organization，WHO）2017年公布的数据显示，动脉粥样硬化(atherosclerosis，AS)所导致的缺血性心脏病(ischemic heartdisease，IHD)和脑卒中等心血管疾病(cardiovascular disease，CVD)仍是全世界最大的健康杀手，年死亡人数约为1500万，是过去15年间全世界第一位死因。进入21世纪，我国IHD患病率和死亡率均不断攀升。寻找更为积极有效的IHD防治措施已成为全民健康事业的迫切需求，故深入研究AS的发生和发展的病理过程至关重要。 　　糖尿病加速AS的分子机制尚未明确，既往关于合并糖尿病的AS易损斑块的研究并未关注高糖直接影响斑块纤维帽内胶原代谢而导致斑块易损;另外，斑块内血管新生因子与炎症反应之间存在着复杂的相互促进的关系，但其具体机制尚无定论;基于上述原因，本文将分别在论文Ⅰ中论述糖尿病对AS斑块易损的影响及具体机制，论文Ⅱ中将对斑块内血管新生因子与炎症反应之间的关系进行深入探讨。 　　目的： 　　(1)在体内实验中明确AMPK及其激活剂二甲双胍对AS斑块稳定性的影响。 　　(2)体外实验中探讨高糖环境对平滑肌细胞内胶原合成通路的影响。 　　(3)体内体外实验同时验证AMPK如何参与调节斑块内胶原代谢。 　　方法： 　　1、动物模型构建 　　第一部分动物实验:100只8周龄雄性ApoE-/-小鼠给予高脂喂养2周后，随机分为四组: 　　1)对照组(Control组，n=25):给予一定体积正常饮用水; 　　2)二甲双胍组(Metformin组，n=25):将二甲双胍粉末溶解于正常饮用水中配制二甲双胍溶液，给予浓度为50 mg/kg/day的二甲双胍溶液，体积同对照组; 　　3)糖尿病组(DM组，n=25):给予同正常对照组等量体积正常饮用水 　　4)糖尿病+二甲双胍组(DM+Metformin组，n=25):将二甲双胍粉末溶解于正常饮用水中配制二甲双胍溶液，给予浓度为50 mg/kg/day的二甲双胍溶液，体积同对照组。 　　第二部分动物实验:100只8周龄雄性ApoE-/-小鼠同样给予高脂喂养2周后，随机分为4组: 　　1)正常血糖+病毒空载体组(Con-Ad-EGFP，n=25):尾静脉注射只携带绿色荧光蛋白(Green fluorescence protein，GFP)的腺病毒(3.0×109 ifu permouse); 　　2)正常血糖+AMPKα腺病毒组(Con-Ad-AMPKα，n=25):给予尾静脉注射携带AMPKα的腺病毒(3.0×109 ifu per mouse); 　　3)糖尿病+病毒空载体组(DM-Ad-EGFP，n=25):尾静脉注射只携带GFP的腺病毒(3.0×109 ifu per mouse); 　　4)糖尿病+ AMPKα腺病毒组(DM-Ad-AMPKα，n=25):给予尾静脉注射携带AMPKα的腺病毒(3.0×109 ifu per mouse)。 　　2、组织病理学检测 　　留取甲醛固定后的右侧颈动脉组织制备冰冻切片，对动脉斑块组织进行H&E染色、油红O染色以及天狼猩红染色。同时，采用免疫组织化学染色的方法检测颈动脉斑块组织内平滑肌细胞，巨噬细胞以及Ⅰ，Ⅲ型胶原蛋白的含量，计算斑块易损指数。 　　3、细胞培养及腺病毒转染 　　人血管平滑肌细胞(human vascular smooth muscle cells，VSMCs)，给予2％胎牛血清(FBS)+青霉素+链霉素，于5％CO2，37℃孵育箱培养，所有实验均使用4-8代细胞。细胞密度达到80％时给予空白病毒载体及AMPKα过表达的腺病毒转染，过夜培养后，换新鲜培养基冲洗后并继续培养24小时，转染效率达80％。 　　4、免疫印迹(Western Blot)检测 　　经过提取细胞、组织蛋白，进行凝胶电泳、转膜、标记一抗和二抗、ECL曝光等步骤观察目的蛋白的表达。 　　5、实时定量聚合酶链反应(RT-PCR) 　　通过特殊miRNA提取试剂盒分别提取细胞及组织miRNA，利用逆转录和RT-PCR的方法对VSMC细胞水平，及颈动脉斑块组织水平的内的内参基因U6，及目的基因miR124进行检测。 　　结果： 　　1、高糖增加ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块不稳定性 　　斑块易损指数计算公式=(油红O+巨噬细胞)/(VSMC+胶原含量)。根据统计分析显示，小鼠体内高糖状态会显著增加斑块内巨噬细胞浸润和油红O染色面积，同时减少纤维帽上平滑肌细胞和胶原的表达，易损指数显著升高，提示糖尿病促进斑块易损。 　　2、二甲双胍增加ApoE-/-小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性 　　为研究二甲双胍的心血管保护作用，给予小鼠12周二甲双胍喂养，结果显示二甲双胍组糖尿病小鼠颈动脉斑块内巨噬细胞浸润、脂质沉积显著降低，纤维帽平滑肌细胞及胶原成分显著增加，提示二甲双胍具有维持斑块稳定的作用。 　　3、二甲双胍激活糖尿病小鼠动脉粥样硬化斑块中AMPKα活性 　　二甲双胍是经典的AMPK激活剂，因此，我们验证了在糖尿病小鼠颈动脉斑块中，二甲双胍通过磷酸化Thr172从而激活AMPKα。提示在糖尿病小鼠体内，二甲双胍通过激活AMPK发挥稳定斑块的作用。 　　4、AMPKα过表达增加糖尿病小鼠动脉粥样硬化斑块稳定性 　　为了明确AMPK在糖尿病促AS斑块易损中发挥的作用，我们构建了AMPKα2过表达病毒,通过尾静脉注射的方式将病毒输送至小鼠体内，结果显示过表达AMPKα可以显著降低颈动脉斑块内巨噬细胞浸润及脂质沉积，同时增加纤维帽层VSMC和胶原的含量，证明了高糖通过抑制AMPKα活性而导致了斑块易损的发生。 　　5、平滑肌细胞内高糖抑制胶原合成 　　给予平滑肌细胞高糖(HG，30 mM，D-glucose)刺激，进行时间梯度实验，结果显示pAMPKα，Ⅰ/Ⅲ型胶原表达均逐渐降低;当我们在VSMC细胞中转染AMPKα过表达腺病毒，胶原表达显著增加，提示高糖通过抑制AMPKα而发挥减少胶原含量的作用。 　　6、AMPKα过表达增加高糖处理的VSMCs中P4Hα1表达 　　HG处理的VSMC中，P4Hα1表达随时间梯度呈降低趋势，过表达AMPKα后，P4Hα1表达升高，提示HG通过AMPKα抑制P4Hα1表达。为了进一步验证P4Hα1对下游胶原合成的影响，在VSMC中过表达P4Hα1基因，可以增加HG刺激组Ⅰ/Ⅲ型胶原的表达，提示HG通过抑制P4Hα1抑制胶原合成。 　　7、miR-124通过结合P4Hα1的3，-UTR区域抑制其表达 　　小RNA(miRNA)是一种约20个核苷酸组成的，单链RNA分子，他们通过结合于目的基因的3’非翻译区域(3’-UTR)从而抑制目的基因的表达。通过运用预测软件，我们发现miR124可以特异性结合于P4Hα1的3’-UTR区降低其表达，我们构建质粒载体，通过双荧光素酶报告基因方法验证了二者间的特异性结合。 　　8、AMPKα过表达可逆转VSMC中HG诱导的miR-124表达上调 　　HG处理的VSMC，miR-124表达明显增加，为了验证AMPK参与这一调控过程，我们在VSMC中转染AMPKα腺病毒，结果显示，在HG环境中，过表达AMPKα可以抑制miR-124的表达，由此提示，AMPK参与了HG调控miR-124的过程。 　　9、转录因子AP-2α负向调控miR-124表达 　　为了验证miR-124的上游调控子，我们利用生物信息学网站预测了miR-124启动子序列在-842到-364bp区间，为了验证这一预测，我们合成了包含这一序列的质粒转染HEK293T细胞，Real-time PCR结果提示相对于空载体组，转染这一启动子序列的质粒会显著增加miR-124的表达，从而确认了预测的准确性。同时，为了证明AP-2α可能具有调控miR-124表达的作用，我们分别在体内、外实验中，过表达或降低表达AP-2α，Real-time PCR结果提示AP-2α具有负相调控miR-124表达的作用。我们利用染色质免疫沉淀(ChIP)分析的方法进一步验证了AP-2α特异性结合于miR-124的启动子序列从而发挥其负向调控作用。 　　结论： 　　(1)糖尿病通过减少小鼠颈动脉斑块纤维帽层胶原含量导致斑块易损。 　　(2)高糖通过抑制AMPKα/ AP-2α/miR-124/P4Hα1信号通路，抑制平滑肌细胞内胶原合成。 　　(3)转录因子AP-2α结合于miR-124的启动子区域从而负向调控其表达。 　　(4)二甲双胍可以通过激活AMPKα/AP-2α/miR-124/P4Hα1发挥稳定AS斑块的作用。