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摘要近年来，我国结直肠癌(colorectal cancer，CRC)新发病例逐年增加，已成为临床上最常见的消化道恶性肿瘤之一。然而，由于结直肠癌早期检出率不高且易发生复发转移，许多患者被确诊时已是晚期，错过了最佳治疗时机，导致结直肠癌患者死亡率很高。因此，探索结直肠癌发生发展的分子机制，寻找可提供早期诊断的分子标记物，对于诊断和治疗该病具有重要的意义。<br>　　研究证实，在肿瘤的发生发展过程中，有一系列基因的差异表达贯穿始终，FAM83D(Family with sequence similarity83D，FAM83D)即是其中之一。FAM83D是FAM83家族成员之一，定位于人类20q染色体中;其主要功能是编码纺锤体相关的蛋白，与有丝分裂密切相关。另外，FAM83D在各种癌症如乳腺癌、肝癌以及肺癌中差异性表达，不仅是诊断和预后潜在的候选基因，而且参与调节癌细胞增殖、凋亡、侵袭和迁移，因此，FAM83D可能成为肿瘤基因治疗的新靶标分子。<br>　　然而，迄今为止，鲜见有关FAM83D在结直肠癌发生发展过程中的生物学功能及其分子机制的研究报道。为探索其作为新靶标分子的可能性，本课题首先采用qRT-PCR技术检测了36对结直肠癌组织和正常结直肠组织中FAM83DmRNA的表达水平，然后应用qRT-PCR以及Western blotting技术检测了7株结直肠癌细胞（Caco-2、RKO、DLD-1、HT-29、LoVo、SW480和HCT116）和一株正常结直肠上皮细胞(NCM460)中FAM83D mRNA及蛋白质的表达。结果表明，FAM83D在结直肠癌组织和细胞中均显著上调。接着，通过观察调控FAM83D表达对结直肠癌细胞SW480和HCT116的增殖、凋亡、侵袭及EMT的影响，初步探讨FAM83D在结直肠癌中发挥生物学功能的分子机制。<br>　　第一部分 FAM83D在结直肠癌组织和细胞中的表达情况<br>　　方法：<br>　　1.收集标本，36例结直肠癌组织标本及癌旁正常结直肠组织标本。<br>　　2.细胞培养，7株结直肠癌细胞(Caco-2、RKO、DLD-1、HT-29、LoVo、SW480和HCT116)和一株正常结直肠上皮细胞(NCM460)。<br>　　3.采用qRT-PCR检测36例结直肠癌组织与对应的36例癌旁正常组织标本中FAM83DmRNA的表达情况。<br>　　4.采用qRT-PCR和Westem blotting方法检测结直肠癌细胞和正常结直肠上皮细胞中FAM83D mRNA和蛋白质的表达情况。<br>　　5.统计学分析:所有实验数据采用均数士标准差方式表示，并使用SPSS17.0软件对得到的数据进行统计分析。另外，单因素方差分析和t检验分析组间差异，其中，P＜0.05被认为差异有统计学意义。<br>　　结果：<br>　　1.与正常结直肠组织比较，在结直肠癌组织中FAM83DmRNA表达显著上调。<br>　　2.与正常结直肠上皮细胞(NCM460)比较，在结直肠癌细胞(Caco-2、RKO、DLD-1、HT-29、LoVo、SW480和HCT116)中FAM83D蛋白质和mRNA表达显著上调，尤其是在SW480和HCT116细胞中(P＜0.01)。<br>　　第二部分 FAM83D对结直肠癌细胞增殖、凋亡、侵袭的影响<br>　　方法：<br>　　1.结直肠癌细胞SW480和HCT116经FAM83D siRNA、negative control siRNA、pcDNA3.1-FAM83D质粒以及空质粒pcDNA3.1negative control转染构建FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞。qRT-PCR和Western blotting方法检测转染后FAM83D mRNA和蛋白质表达情况确定。<br>　　2.实验分组:Control组:结直肠癌细胞（SW480和HCT116）正常培养，未做处理;pcFAM83D组:仅转染pcDNA3.1-FAM83D质粒;siFAM83D组:仅转染FAM83D siRNA;过表达对照组(pcNC):仅转染pcDNA3.1-空载质粒;沉默对照组(siNC):转染siRNA negative control。<br>　　3.MTT法检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的增殖。<br>　　4.克隆形成实验检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的克隆形成能力。<br>　　5.Cell Death Detection ELISA检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞凋亡。<br>　　6.应用Transwell实验检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的侵袭能力。<br>　　7.Western blotting和qRT-PCR检测FAM83D过表达和沉默的结直肠癌细胞SW480和HCT116中相关凋亡和EMT基因的蛋白质和mRNA表达。<br>　　8.统计学分析:所有数据用均数士标准差表示，运用SPSS17.0软件进行统计分析。并单因素方差分析和t检验分析，P＜0.05被认为差异有统计学意义。<br>　　结果：<br>　　1.qRT-PCR结果显示，与转染空质粒pcDNA3.1negative control(pcNC)比较，转染pcDNA3.1-FAM83D质粒后，SW480和HCT116细胞FAM83D mRNA表达水平分别上升至250％和280％，差异具有统计学意义(P＜0.05)。此外，与negative control siRNA组比较，SW480和HCT116细胞经FAM83D siRNA干扰后，FAM83D mRNA表达水平分别降低至30％和20％，差异具有统计学意义（P＜0.05）。Western blotting结果显示，SW480和HCT116细胞经转染pcDNA3.1-FAM83D质粒后，FAM83D蛋白质表达水平显著升高(P＜0.05)。此外，经FAM83D siRNA干扰SW480和HCT116细胞后，FAM83D蛋白质表达水平显著降低(P＜0.05)。<br>　　2.MTT法检测结果表明，使用siRNA干扰技术敲除FAM83D可以抑制结直肠癌细胞增殖。此外，FAM83D过表达促进结直肠癌细胞增殖。<br>　　3.克隆形成实验结果表明，使用siRNA干扰技术敲除FAM83D可以抑制结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞的克隆形成。此外，FAM83D过表达促进SW480和HCT116中细胞的克隆形成。<br>　　4.Cell Death Detection ELISA检测结果表明，FAM83D沉默使结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞凋亡显著升高。此外，FAM83D过表达使结直肠癌细胞SW480和HCT116中细胞凋亡显著降低。<br>　　5.Transwell实验结果表明FAM83D沉默降低结直肠癌细胞侵袭的细胞数，而FAM83D过表达增加结直肠癌侵袭的细胞数。<br>　　6.Western blotting和qRT-PCR检测结果表明，FAM83D沉默显著增加Bax、caspase-3以及caspase-9基因的蛋白质和mRNA表达，并显著降低Bcl-2和Bcl-x1的蛋白质和mRNA表达(P＜0.05)。FAM83D过表达显著降低Bax、caspase-3以及caspase-9基因的蛋白质和mRNA表达，并显著升高Bcl-2和Bcl-x1的蛋白质和mRNA表达(P＜0.05)。此外，FAM83D沉默促进E-cadherin的蛋白质和mRNA表达(P＜0.05)，降低β-catenin、N-cadherin、vimentin和Snail的蛋白质及mRNA表达。FAM83D过表达显著降低E-cadherin的蛋白质和mRNA表达，促进β-catenin、N-cadherin、vimentin和Snail的蛋白质和mRNA表达(P＜0.05)。<br>　　结论：<br>　　在结直肠癌细胞SW480和HCT116中，FAM83D沉默抑制细胞增殖和克隆形成、促进细胞凋亡、降低细胞侵袭以及抑制EMT过程。此外，FAM83D过表达促进结直肠癌细胞增殖和克隆形成、抑制细胞凋亡、增加细胞侵袭以及诱导EMT过程。