检索历史 清除

摘要Elongator是六亚基复合物，具有组蛋白乙酰转移酶活性和功能完整性。其催化亚基Elp3具有HAT和SAM两保守结构域。在酿酒酵母中，氧化胁迫应答主要通过转录因子Yapl调控和放大，正常条件下，Yap1在细胞质中弥散分布，但在过氧化氢胁迫下，Yapl发生核积累现象，激活一系列抗氧化基因的表达。本实验室前期工作表明Elp3亚基缺失或减弱其HAT活性的点突变都可影响Elongator功能，均能使酵母产生过氧化氢敏感表型。为了研究Elp3亚基是否通过Yap1途径参与酵母氧化应激反应。本文以野生型(WT)、elp3△菌株为实验材料，用过氧化氢处理两菌株，分别进行了Yap1核定位、活性及其靶基因表达测定。实验结果表明Elp3缺失影响了Yap1的核定位，在elp3△菌株中其核积累明显减少，但通过报告基因的测定表明elp3△菌株中Yap1的活性显著高于野生型菌株;qRT-PCR结果表明Elp3缺失严重影响了Yap1靶基因的表达。上述实验表明过氧化氢胁迫下，Elp3通过改变转录因子Yap1的核积累和活性、调控抗氧化基因的表达来参与酿酒酵母的氧化应激反应。<br>　　酿酒酵母与其他真核生物一样含有两个超氧化物歧化酶(SOD1、SOD2)，在清除胞内ROS过程中起重要作用，在氧化应激反应中热激蛋白有分子伴侣等多重功能，本文通过qRT-PCR和Western Blot实验比较了野生型(WT)、elp3△菌株中SOD1、SOD2及不同家族的热激蛋白(Hsp75、Hsp105)的表达，结果表明Elp3亚基缺失对SOD转录和翻译都有一定影响，其中Hsp105蛋白表达量显著下降。表明Elp3可能参与上述氧化应激相关基因的表达调控。<br>　　ROS含量及细胞MDA水平可以直观表现细胞内氧化还原状态，本文分别用NBT和TBA法测定细胞内ROS含量及MDA水平，结果表明elp3△菌株内ROS含量及MDA水平大幅提高，达到显著差异(P＜0.05)。表明在氧化胁迫条件下，Elp3缺失使得酵母细胞内处于高度氧化的状态。接着进行了胞内谷胱甘肽过氧化物酶(GPX)活性及胞内总蛋白含量测定，结果表明elp3△菌株的GPX酶活总是低于WT，且胞内蛋白含量显著低于野生型。这说明Elp3缺失菌株对氧化剂耐受性降低与其抗氧化酶活性变化及胞内ROS水平有关。<br>　　二酰胺是一种常用的氧化剂，其诱导酵母氧化应激机制与过氧化氢不同，为了进一步研究Elp3缺失是否也对二酰胺的耐受性有影响，我们以野生型(WT)、elp3△及转入完整和部分缺失Elp3的转化株为材料，对不同浓度二酰胺处理的各菌株进行了敏感性实验和生长曲线绘制。结果表明elp3△菌株对二酰胺高度敏感，胁迫下人全长及酵母两保守结构域缺失的elp3△转化株的生长情况与elp3△菌株相似，而转入酵母全长ELP3的elp3△转化株与WT表型相似，且高温胁迫可以加剧各菌株对氧化剂的敏感性，表明Elp3及其两保守结构域缺失均可降低酿酒酵母的二酰胺耐受性，人Elp3对elp3△菌株二酰胺敏感表型无明显补偿作用。上述结果证实Elp3两保守结构域对Elp3调控酵母氧化应激反应功能极为重要。