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摘要锦鲤（Cyprinus carpio var.Koi），属于辐鳍鱼亚纲（Actinopterygii），鲤形目(Cypriniformes)，鲤科（Cyprinidae），鲤属（Cyprinus）。是风靡当今世界的一种高档观赏鱼，有“水中活宝石”、“会游泳的艺术品”的美称。它是鲤鱼的杂交变异品种，由于养殖环境变化引起体色突变，通过长期的人工选育和杂交培育而来。目前在鱼类体色等方面的研究已经开展很多，但较集中于一些模式生物，例如斑马鱼(Danio rerio)、青鳉（Oryzias latipes）或者一些体色遗传相对单一的观赏鱼类。由于锦鲤遗传背景复杂，种类繁多，色彩多样，对锦鲤体色的研究还处于较基础的层面，关于锦鲤体色的成因还有待进一步的探索分析。小眼畸形相关转录因子(Micropthalmia-related transcription factor，mitf)和酪氨酸酶(Tyrosinase，tyr)基因是黑色素合成通路中两个十分重要的调控基因，mitfa基因作为转录因子可以与tyr基因启动子上的“M-box”结构结合调控黑色素的合成。黄嘌呤脱氢酶（Xanthine dehydrogenase，xdh）是嘌呤代谢和蝶啶生物合成过程中的关键生物合成酶。嘌呤类色素及其代谢物、蝶啶及其衍生物是鱼类色素细胞中的主要色素成分之一，xdh在一定程度上能够影响嘌呤代谢和蝶啶生物物质的合成调节鱼类体色的形成。本文以锦鲤为实验材料，首先克隆得到xdh cDNA序列全长，对其进行生物信息学分析，并检测其在其锦鲤各组织中的表达情况。其次，观察锦鲤的体色发生过程，并研究xdh、mitfa、tyr体色相关基因在体色发生阶段的表达情况。同时对不同体色锦鲤的皮肤、鳞片和鳍条中xdh进行表达差异分析。为进一步研究xdh蛋白水平的表达，通过原核表达制备了xdh多克隆抗体，并利用免疫组化的方法对锦鲤皮肤中的xdh蛋白进行表达定位分析。此外，预测了xdh的候选microRNAs(miRNAs)，并对候选miRNAs在体色发生阶段的表达情况进行了检测，为进一步探讨xdh基因在锦鲤体色形成中的作用提供参考数据。<br>　　1、锦鲤xdh基因全长的克隆及表达分析<br>　　本章以红色锦鲤皮肤总RNA为模板，利用RACE方法扩增xdh基因cDNA全长，实时荧光定量(qRT-PCR)分析xdh基因在7个组织中的表达情况。结果显示:锦鲤xdh基因cDNA全长4197bp，其中ORF长4035bp，编码1344个氨基酸，5'-UTR长18bp，3'-UTR长144bp，蛋白同源分析发现锦鲤xdh基因与鲤科鱼类相似性较高，与其他鱼类及鸟类等脊椎动物相似性较低。系统进化分析显示锦鲤xdh与鲤、金钱鲤、斑马鱼等鲤科鱼类的亲缘关系较近。qRT-PCR结果发现xdh在锦鲤7个组织中均有表达，肾脏中表达量最高，鳞片中表达量最低。<br>　　2、红色锦鲤体色发生观察及体色相关基因的表达分析<br>　　本章描述了红色锦鲤从出膜到体色形成的过程，总结和归纳了不同发育阶段体色变化的异同点，筛选出6个体色变化较为显著的时期，分别为1、2、3、4、12和48dph(day post hatching)。利用qRT-PCR分析了xdh、mitfa和tyr基因在红色锦鲤6个体色变化关键时期的表达情况。结果显示:xdh基因在48dph时表达量最高，极显著高于3dph时(P＜0.05)，两个阶段xdh基因均极显著高于其他4个时期(P＜0.01)。xdh基因在4dph时表达量显著高于1、2和12dph3个时期(P＜0.05)。1、2和12dph3个时期xdh表达量不存在显著差异(P＞0.05)。mitfa基因在1dph时表达量最高，显著高于48dph时(P＜0.05)，两个阶段mitfa基因表达量均极显著高于其他4个时期(P＜0.01)。2、3、4和12dph4个时期mitfa表达量较低且不存在显著差异(P＞0.05)。tyr基因在1dph时表达量最高(P＜0.01)，4dph时表达量显著高于12、48dph(P＜0.05)，与2、3dph不存在显著差异（P＞0.05）。tyr在2、3、12、48dph4个时期差异不显著(P＞0.05)。xdh、mitfa和tyr基因在红色锦鲤体色形成过程中表达趋势具有一定差异，xdh基因表达量表现为先升高后降低再升高，mitfa基因与tyr基因表达趋势相似，随着体色的形成表达量逐渐降低。<br>　　3、不同体色锦鲤皮肤、鳞片和鳍条中xdh的表达分析<br>　　本章分别以红色锦鲤、红白锦鲤、红白锦鲤的皮肤、鳞片和鳍条的总RNA为模板，分析xdh基因在不同体色锦鲤中的表达差异情况。结果显示:在皮肤中，白色锦鲤xdh表达量最高(P＜0.05)、红白锦鲤中白色皮肤的表达量相对较低，但与红白锦鲤中红色皮肤和红色锦鲤无显著差异（P＞0.05）。在鳞片中，红白锦鲤红色鳞片中表达量最高(P＜0.05)，红白锦鲤白色鳞片中表达量次之(P＜0.05)，红色锦鲤和白色锦鲤鳞片中表达量最低，且两者不存在显著差异（P＞0.05）。在鳍条中，红白锦鲤白色鳍条中表达量最高，显著高于红色锦鲤(P＜0.05)，与白色锦鲤间不存在显著差异(P＞0.05)。红色锦鲤和白色锦鲤鳍条中xdh的表达量不存在显著差异(P＞0.05)。<br>　　4、锦鲤xdh基因的原核表达及多克隆抗体的制备<br>　　本章利用克隆获得的xdh基因cDNA序列，设计限制性酶切位点为HindⅢ和BamHⅠ，将编码xdh基因抗原决定簇99个氨基酸残基的核苷酸片段连接至pET-32a(+)。将阳性重组子转化至大肠杆菌感受态细胞BL2(DE3)中得到重组菌，且能够表达相应的蛋白，利用1％浓度的IPTG对重组菌进行诱导表达，诱导之后从菌液中提取出目的蛋白，将目的蛋白进行纯化，免疫兔子，制备xdh多克隆抗体，通过免疫组化的方法检测xdh在锦鲤皮肤中的表达定位。<br>　　5、xdh候选miRNAs预测及表达差异分析<br>　　本章根据xdh基因的3'-UTR序列，结合不同发育时期RNA-seq数据库筛选出的体色相关miRNAs，利用RNAhybrid软件预测xdh基因的候选miRNAs，结合xdh基因与miRNAs不同发育时期的表达情况，筛选出可能靶向作用与xdh影响体色形成的候选miRNAs。