黑曲霉磷酸果糖激酶与小分子代谢物相互作用的研究-论文-万方医学网

黑曲霉磷酸果糖激酶与小分子代谢物相互作用的研究

收藏纠错

摘要黑曲霉(Aspergillus niger)是一种重要的工业微生物，广泛应用于工业酶制剂和有机酸的发酵生产，是柠檬酸的主要生产菌。已有研究重构了黑曲霉的代谢网络模型，但对其代谢调控机制的认识尚不完善。小分子代谢物通过与以磷酸果糖激酶(PFK)为代表的一系列关键酶发生相互作用，从酶活性水平调控黑曲霉胞内核心代谢途径。本研究以PFK为研究对象，探索建立基于高产柠檬酸黑曲霉胞内代谢物组的超滤-液质联用方法，体外筛选与PFK作用的小分子代谢物，力图更全面地描绘PFK受到的调控作用。本文研究内容及结果如下:<br>　　1.在黑曲霉G1中过表达了GST-PFK融合蛋白，提取获得了纯酶，酶活检测确认有活性，比活力为0.35+0.09U/mg;<br>　　2.选择了产酸水平与常用柠檬酸发酵培养基接近的完全培养基（含14％葡萄糖），有效地避免了原发酵培养基中不溶性玉米粉对代谢物提取的干扰;系统地评价了黑曲霉胞内代谢组提取的方法，通过比较不同淬灭方法的淬灭效果和提取剂的提取效果，确认-20℃40％甲醇+抽滤的最优淬灭方法，煮沸乙醇和50％乙腈的最优提取方法;<br>　　3.建立了黑曲霉关键酶和小分子相互作用的超滤-液质联用筛选方法，并首次从高产柠檬酸黑曲霉胞内代谢组中筛选到了5种尚未报道的与PFK发生作用的小分子代谢物，分别为:谷氨酸、焦谷氨酸、琥珀酸、山梨醇和半乳糖醇。经SPR和酶活检测证实了该相互作用关系确实存在。<br>　　本研究丰富了磷酸果糖激酶的代谢调控关系，为构建高效的黑曲霉细胞工厂提供了新思路;建立的黑曲霉胞内代谢物组提取方法及超滤-液质联用体外筛选相互作用对的方法，为系统地解析黑曲霉代谢调控机制提供了有效的工具。