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摘要活性氧自由基(ROS)是生物有氧代谢的副产物，包括超氧阴离子(O2-)，羟自由基(·OH)和过氧化氢(H2O2)。高浓度的ROS损伤生物大分子抑制细胞生长，但低浓度的ROS可作为信号调控细菌的抗氧胁迫。抗氧胁迫是细菌存活及致病的基础，已知的细菌抗氧机制包括(1)ROS清除酶如超氧化物歧化酶(SOD)、过氧化氢酶和硫醇过氧化物酶(Tpx);(2)调控胞内金属离子动态平衡，如摄取锰(Mn)和螯合铁(Fe)可清除和淬灭ROS并防止Fenton反应;(3)维持细胞氧化还原平衡的硫氧还蛋白(Trx)和谷胱甘肽(GSH)系统;(4)修复氧化损伤分子，如甲硫氨酸亚砜还原酶(MsrAB)及分子伴侣对蛋白聚集的保护作用。细菌对氧化胁迫的响应主要通过相关调控蛋白半胱氨酸的翻译后修饰实现，如大肠杆菌的OxyR蛋白被H2O2氧化形成二硫键时激活下游抗氧基因表达，枯草芽孢杆菌的过氧化物响应抑制蛋白PerR则是通过Fenton反应导致的组氨酸残基不可逆氧化失活而解除对抗氧基因的抑制。<br>　　本论文的研究对象寡发酵链球菌(Streptococcus oligofermentans)分离自健康人口腔，不含过氧化氢酶，却能产生并耐受高浓度的H2O2，因此可作为细菌抗氧胁迫机制的研究模型。前期研究发现低浓度H2O2预处理该菌可使其耐受高浓度H2O2，即使失活已知的过氧化物响应抑制蛋白基因perR，失活株的H2O2预处理仍能提高该菌的H2O2存活率。这说明该菌仍有未知的、不依赖于PerR的抗氧保护机制。本论文利用氧化还原组学鉴定含H2O2敏感巯基的蛋白，并结合H2O2响应的转录谱及蛋白谱分析，探讨H2O2导致的翻译后修饰的贡献;通过生化、遗传及抗氧生理分析，揭示组学分析中发现的H2O2响应蛋白MntR的抗氧胁迫机制。获得如下研究结果:<br>　　1.寡发酵链球菌利用转录、翻译及蛋白翻译后修饰的协调调控策略，实现抗H2O2胁迫:基因芯片检测到寡发酵链球菌响应H2O2的差异转录基因共有473个，功能涉及一系列的氧化应激反应和适应过程，如清除ROS和调节氧还状态，调节金属离子平衡和辅酶代谢，对蛋白和DNA的修复和普通胁迫响应，和中心代谢途径（包括核酸、氨基酸和碳水化合物代谢）等生理过程。响应H2O2调控网络包括PerR调控元，碳代谢物阻遏蛋白CcpA，ArgR，CodY和CopY调控元的部分基因。蛋白组分析发现180个蛋白响应H2O2差异表达，碳代谢和氨基酸代谢途径的基因在蛋白水平与转录水平的差异表达趋势部分相同。而在转录与蛋白翻译水平对H2O2响应不一致的部分蛋白在氧化还原组中发现其半胱氨酸残基多被氧化修饰。有趣的是，H2O2作用下锰转录抑制基因mntR上调表达，而蛋白水平下降，并且氧化还原组学分析发现MntR的半胱氨酸形成二硫键，提示MntR受H2O2的翻译后修饰调控。<br>　　2.金属调控蛋白MntR响应H2O2调控锰摄取并赋予细菌抗氧胁迫能力:细胞金属离子平衡是链球菌抗氧胁迫的重要策略。研究发现寡发酵链球菌锰调控蛋白MntR特异结合锰摄取基因mntABC启动子，并调控胞内锰、铁离子的水平。非还原SDS-PAGE检测到纯化的MntR蛋白被H2O2氧化形成分子间二硫键交联的二聚体，质谱分析表明该二聚体主要是Cys-11与Cys-156及Cys-11与Cys-11的交联。凝胶阻滞实验(EMSA)发现H2O2处理解离MntR结合mntABC启动子，而DTT恢复其结合，提示H2O2通过氧化半胱氨酸而影响MntR功能。Western Blot检测到H2O2处理细菌使细胞内的MntR形成二硫键交联寡聚体，并很快被降解。Luciferase报告菌株显示，H2O2处理提高mntABC的表达。mntR失活可提高寡发酵链球菌的H2O2胁迫存活率，表明mntABC通过摄取锰离子，帮助细菌抗氧胁迫。<br>　　为确证MntR的3个半胱氨酸在感应H2O2并实现调控中的作用，我们通过EMSA和非还原SDS-PAGE发现Cys11或Cys156突变显著降低H2O2氧化的二硫键交联二聚体和H2O2的去抑制作用;Redox-westem检测到H2O2导致胞内MntR和C123S蛋白的降解，但C11S和C156S蛋白的降解减少，说明Cys11和Cys156是H2O2的氧化位点。定量PCR也证实H2O2处理不影响C11S和C156S回补菌株mntABC的表达。同时，Cys11和Cys156点突变后细胞锰水平和H2O2存活率较低，而Cys123点突变的细胞锰水平和H2O2存活率均显著提高。本工作揭示了MntR感应Mn和H2O2的双重机制。<br>　　3.PerR调控的基因谱分析，发现新的抗H2O2功能基因:通过基因芯片分析PerR基因突变株响应H2O2的差异表达基因谱。我们将野生株响应H2O2但perR突变株不响应的基因定义为PerR依赖的H2O2响应基因。这类基因共有265个，包括抗氧化胁迫和金属离子平衡基因，DNA代谢和修复基因，氨基酸和糖类代谢基因;说明PerR调控这些功能基因协同抗氧。EMSA实验证明PerR结合自身启动子和假定的Mn2+/Fe2+转运基因pcl1，但其他大部分基因的启动子不存在PerR结合的per-box序列，推测PerR对其为间接调控。通过外源添加Mn2+和Fe2+发现金属离子影响PerR对同一基因调控。遗传和生理初步分析发现依赖PerR的多聚磷酸合成基因vtc和不依赖PerR的多重耐药阻遏基因marR具有抗氧胁迫功能，其机制有待进一步研究。<br>　　综上所述，本研究揭示了无触酶寡发酵链球菌新的抗氧胁迫策略，即在转录、翻译及蛋白翻译后修饰水平协调调控，利用氧还调节的转录调控蛋白调控金属离子平衡，通过H2O2敏感的巯基蛋白影响多重生理代谢功能，以应对氧化压力胁迫。组学分析发现H2O2胁迫下部分mRNA与蛋白水平的不一致由翻译后修饰介导，验证锰调控蛋白MntR通过H2O2氧化形成二硫键交联聚体，失活并降解的机制诱导锰摄取基因mntABC的表达，实现抗氧胁迫。氧化还原组分析发现的其他被H2O2氧化的蛋白功能需进一步研究。