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摘要糖尿病是一种严重且多发的慢性疾病，高血糖是糖尿病的最主要特征。肝脏糖代谢在机体糖稳态维持中发挥重要作用，肝脏糖代谢紊乱是高血糖的主要成因。我们前期研究发现，天然活性产物乌药醚内酯和姜花素A均可显著抑制原代培养大鼠肝细胞糖异生，同时，姜花素A还可促进原代大鼠肝细胞糖原合成。本论文将对乌药醚内酯和姜花素A调控肝细胞糖代谢的分子机制进行系统研究，并对乌药醚内酯和姜花素A的抗糖尿病药效进行评价，为这两个化合物作为抗糖尿病活性先导化合物的进一步开发提供实验依据和理论基础。<br>　　本论文分为以下两部分:<br>　　第一部分:天然活性产物乌药醚内酯对肝脏糖异生的调控作用及机制研究<br>　　研究目的:<br>　　抑制肝糖异生是改善2型糖尿病空腹血糖的有效手段。本课题采用大鼠原代肝细胞模型评价乌药醚内酯对于糖异生及糖异生关键基因表达的影响，探索乌药醚内酯抑制肝糖异生的机制，并在体内模型上评价乌药醚内酯抗糖尿病的效果。<br>　　实验方法:<br>　　采用大鼠原代肝细胞研究乌药醚内酯在基础水平和毛喉素(Forskolin)诱导条件下对于糖异生功能的影响，并采用Real-time PCR检测糖异生关键酶磷酸烯醇丙酮酸羧激酶(phosphoenolpyruvate Carboxykinase,PEPCK)和葡萄糖-6-磷酸酶(glucose-6-phosphatase，G6Pase)编码基因mRNA表达。采用cAMP ELISA kit检测乌药醚内酯对于大鼠原代肝细胞cAMP含量的影响，并用Western blot检测环磷腺苷效应元件结合蛋白(cAMP-response element binding protein，CREB)、细胞外蛋白调节激酶(extracellular regulated protein kinases，ERK)和信号传导子及转录激活子3（signal transducer and activator of transcription3，STAT3）的磷酸化水平。采用PDE activity assay kit（磷酸二酯酶活性检测试剂盒）检测乌药醚内酯对于总PDE和PDE3的间接作用和直接作用，并利用小分子抑制剂探索乌药醚内酯抑制肝糖异生的机制。在C57BL/6小鼠上评价乌药醚内酯单次给药后对于肝脏PDE的影响，并在2型糖尿病ob/ob小鼠上评价乌药醚内酯长期给药后的糖尿病治疗效果。<br>　　实验结果:<br>　　乌药醚内酯在基础水平和Forskolin诱导条件下均可显著抑制原代大鼠肝细胞糖异生，减少糖异生关键基因PEPCK和G6Pase mRNA表达，同时降低细胞内cAMP含量和CREB磷酸化。乌药醚内酯可显著增加细胞中ERK和STAT3的磷酸化，并通过ERK/STAT3信号通路间接激活PDE，促进cAMP的降解，且PDE广谱性抑制剂IBMX和PDE3特异性抑制剂Cilostazol均可逆转乌药醚内酯对于cAMP/CREB信号通路和糖异生的抑制作用。体内实验结果显示，乌药醚内酯单次给药后可增加C57BL/6小鼠肝脏ERK和STAT3磷酸化水平，增加肝脏PDE活性，抑制cAMP/CREB信号通路。而乌药醚内酯长期口服给药可以降低ob/ob小鼠空腹血糖、随机血糖及糖化血红蛋白水平，同时也可减少血清和肝脏甘油三酯含量。<br>　　研究结论:<br>　　乌药醚内酯通过ERK/STAT3间接激活肝脏PDE3，抑制cAMP/CREB信号通路，最终抑制肝糖异生。乌药醚内酯可以改善2型糖尿病ob/ob小鼠高血糖症状，并且改善脂代谢。本论文以乌药醚内酯为小分子探针，阐明了肝脏PDE3激活对于糖异生的调控作用，也为基于乌药醚内酯的抗糖尿病活性先导化合物发现提供了理论基础和实验依据。<br>　　第二部分:天然活性产物姜花素A对肝脏糖原合成和糖异生的调控作用及机制研究<br>　　研究目的:<br>　　同时调控肝脏糖原合成和糖异生可能有利于改善糖尿病症状。本课题在体外表型筛选模型上发现天然产物姜花素A可以显著增加肝细胞糖原合成，抑制肝糖异生。在此基础上本课题系统研究姜花素A调控肝脏糖代谢的分子机制，并研究了姜花素A长期给药后对2型糖尿病ob/ob小鼠的治疗作用。<br>　　实验方法:<br>　　在大鼠原代肝细胞上研究姜花素A对于糖原合成的作用，并利用Western blot检测姜花素A对于肝细胞Akt和GSK3p磷酸化的影响。采用磷脂酰肌醇3-激酶(phosphatidylinositol-3-kinase，PI3K)和蛋白激酶B(protein kinase B，Akt)的小分子抑制剂研究姜花素A增加糖原合成与PI3K/Akt信号通路的关系。采用Westem blot检测姜花素A对于大鼠原代肝细胞mTOR、S6K、S6和IRSI Ser1101磷酸化的影响。在大鼠原代肝细胞上研究姜花素A对于糖异生的作用，并利用Real-time PCR检测PEPCK和G6Pase mRNA的表达。检测姜花素A对于肝细胞转录因子7类似物2（transcription factor7like2，TCF7L2）及其下游mRNA的表达的影响，并利用Western blot检测ERK和p．链蛋白(β-catenin)的磷酸化水平。考察姜花素A长期腹腔给药和口服长期给药后对ob/ob小鼠糖脂代谢的影响。<br>　　实验结果:<br>　　姜花素A可以时间依赖性和剂量依赖性增加大鼠原代肝细胞糖原合成，且PI3K和Akt的小分子抑制剂可以逆转姜花素A对于糖原合成的促进作用。姜花素A通过抑制哺乳动物雷帕霉素靶蛋白复合体1(mammalian target of rapamycin complex1，mTORC1)，减少S6K对于IRS1的抑制，从而激活PI3K/Akt信号通路，增加大鼠原代肝细胞糖原合成。姜花素A在基础水平和Forskolin诱导条件下均可显著抑制大鼠原代肝细胞糖异生，并且该作用可以被ERK和Wnt小分子抑制剂逆转。姜花素A通过激活肝细胞中ERK激活Wnt信号通路，形成β-catenin/TCF7L2复合体，抑制糖异生关键基因PEPCK和G6Pase mRNA的表达，最终抑制肝糖异生。姜花素A长期口服给药后可显著增加2型糖尿病ob/ob小鼠的肝脏糖原含量，抑制肝脏糖异生。同时，姜花素A长期腹腔注射和口服给药均可显著降低2型糖尿病ob/ob小鼠随机血糖和空腹血糖，改善口服糖耐量。<br>　　研究结论:<br>　　姜花素A对肝脏糖代谢调控具有促进糖原合成和抑制糖异生的双重活性。姜花素A通过抑制mTORC1激活PBK/Akt信号通路促进肝细胞糖原合成，通过激活ERK/β-catenin信号通路抑制肝糖异生。姜花素A长期给药后可显著改善ob/ob小鼠糖脂代谢。本研究阐明了姜花素A的抗糖尿病作用及其分子机制，为姜花素A的进一步开发提供了理论基础和实验依据。