检索历史 清除

摘要酵母是细胞生物学、临床医学、遗传学等研究领域的重要模式生物，还是食品、饮品、饲料生产及加工过程中的重要工业微生物，更是生物技术产品研发的热点。尤其，酵母细胞壁中富含多糖、对食品及粮食中积累的毒素具有较好的吸附作用，使酵母细胞壁亦成为重要的生物资源。但由于酵母细胞壁较厚，现有细胞壁的获取方法较粗放，常在制备过程中使细胞大量破裂而释放出细胞内容物，影响所得细胞壁纯度，降低其吸附效率。因此，急需找到一种温和且高效的细胞壁分离方法，以获得高质量的酵母细胞壁。<br>　　藤黄节杆菌（Arthrobacter luteus）是一种可高效裂解酵母细胞的放线菌，可通过酵母诱导表达出大量胞壁降解酶类(Lyticase)。但诱导的酶类成分较为复杂，除胞壁降解酶类还包含一些DNA酶类，且纯化效率较低。因此，本研究拟全面解析藤黄节杆菌中受到酵母诱导表达的胞壁降解酶类，构建这些酶的高效表达重组菌株，为酵母原生质体及细胞壁分离提供工具酶。本研究首先对藤黄节杆菌进行了全基因组测序，并以酵母诱导其分泌胞壁降解酶，经SDS-PAGE比较诱导组与未诱导组的差异蛋白条带，再进行质谱分析，解析差异蛋白种类。通过大肠杆菌原核表达系统制备重组胞壁降解酶。主要研究结果如下:<br>　　1、由基因组测序得到了藤黄节杆菌的基因组全长约4.582Mb，共有3600个可读编码序列，tRNA、rRNA为78个，GC比含量约74％。<br>　　2、经质谱检测酵母诱导组胞外粗酶的差异蛋白质组，结果表明，约40个分泌蛋白质参与到了裂解酵母细胞壁的过程中，最后筛选出了8个差异表达明显的基因，分别是:β-葡萄糖苷酶（Beta-glucosidase，EC3.2.1.21，2个）、β-半乳糖苷酶(Beta-galactosidase，EC3.2.1.23)、内切木聚糖酶(Endo-1，4-beta-xylanase)、α-1，2-甘露糖苷酶（Alpha-1，2-mannosidase）、α-葡萄糖苷酶(Alpha-glucosidase，EC3.2.1.20)、糖苷水解酶(COG1649predicted glycoside hydrolase)、蛋白酶(Peptidase S8and S53,subtilisin,kexin,sedolisin)。<br>　　3、以藤黄节杆菌的基因组DNA为模板进行PCR扩增，成功克隆了8个基因，并将其与表达载体pET28a与pET32a进行了连接，通过转化至大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)菌株中进行诱导、表达，并将目的蛋白经Ni柱、Q柱纯化，分别得到了这8种酶的原核表达产物。<br>　　4、将8种重组酶组合成重组胞壁降解酶对酵母细胞进行裂解细胞壁实验，裂解率达到粗酶的49倍，纯化后的β-葡萄糖苷酶中最高的酶活为49.78U/g，β-半乳糖苷酶最高酶活为116.43U/g，内切木聚糖酶最高酶活为75.29U/g。<br>　　目前对酵母细胞壁的裂解方法主要有细胞自溶法、机械破碎法、酶解法及酸碱法等，本研究采用的酶解法相较于其他几种方法具有省时省力，对酵母细胞内蛋白损耗较小等优点。重组胞壁降解酶则又改正了粗酶制备耗时长，成本高，引入杂酶多且难去除等缺点，该酶即可实验研究使用又可用于工业化生产，且其中的单一酶组分也具有一定的研究及生产价值。