检索历史 清除

摘要顺铂(Cisplatin，DDP)是一种含铂的金属络合物，含铂联合化疗的方案是晚期食管鳞癌的基本治疗方法，也是局部晚期食管鳞癌术前新辅助治疗的重要方案之一。但其治疗食管鳞癌的有效率只有40％-60％，DDP化疗耐药是影响治疗食管癌治疗效果的“瓶颈”。因此，对食管鳞癌DDP化疗耐药机制的理解，有助于逆转食管鳞癌对DDP耐药性，对提高食管鳞癌综合治疗的效果意义深远。<br>　　近几年，已经发现的长链非编码RNA（lncRNA）参与多种恶性肿瘤的化疗耐药机制，如在乳腺癌、胃癌和非小细胞肺癌当中均有发现。此外，血浆中检测的某些lncRNAs表达水平与食管癌中的根治性放化疗敏感性相关，lncRNAs可以作为生物标记物，用于评估患者是否从放化疗中获益。但lncRNAs在食管癌DDP耐药中的作用机制研究甚少，本研究旨在通过筛选人食管鳞癌耐药细胞株TE-1/DDP与DDP耐药相关的lncRNA和mRNA，研究其潜在的作用机制。1991年Bartolomei发现了第一个长链非编码RNA为H19。2002年，Okazaki等人首次明确地定义lncRNAs为长度大于200个核苷酸的转录物。人类基因组计划显示，只有不到2％的基因组编码蛋白质，而超过98％的基因组被转录成非编码RNAs（ncRNAs）。更令人意外的是，发现76％的ncRNAs被转录成lncRNAs，其中大多数由RNA聚合酶Ⅱ转录。lncRNAs中没有开放阅读框架（ORF）结构，即使有一个ORF，也不能翻译几个，导致仅少数肽的翻译。大多数lncRNAs具有明显的时间和空间表达特异性，且序列保守性较低。近几年，发现lncRNAs在表观遗传调控、转录以及转录后调控中发挥核心作用;lncRNAs在疾病的发生中也具有结构和功能的作用，尤其是在肿瘤的发生中。因此，更好地了解lncRNA的表达变化可能为肿瘤的诊断提供重要线索。<br>　　lncRNAs可以分为以下几类:①启动子相关转录物:来自启动子区域的转录物;②sense:lncRNAs和mRNAs存在于同一条链上，具有重叠的外显子;③antisense:在相反链上存在于同一链上的lncRNAs和mRNAs，至少有一个外显子重叠;④bidirectional:lncRNA及其相邻基因的转录起始位点位于反义链上;⑤intronic:lncRNAs来源于第二种转录本的内含子，如前体mRNA;⑥intergenic:lncRNAs来源于两个基因序列之间的基因组间隔;⑦3'UTR相关转录本:lncRNAs来源于3'UTR区域。与mRNAs类似，lncRNAs也可以存在于细胞核或细胞质中，但主要位于细胞核尤其是染色质中。<br>　　与mRNAs和蛋白质相比，由于lncRNAs的复杂性和多样性，其功能不能简单地根据它们的结构或序列来描述，但lncRNAs的一个重要作用是调控相邻蛋白质编码基因的表达。此外，潜在的分子机制包括组蛋白修饰、DNA甲基化、剪接调控和蛋白泛素化。<br>　　二代测序技术(next generation sequencing，NGS)通过提供检测体细胞癌基因组变化的综合方法，彻底改变了肿瘤基因组学的研究，提高了我们对肿瘤生物学的认识和理解。进行研究对象全基因组序列的重新测序，再与参考序列进行比对，可以发现个体差异的分子基础，以寻找疾病的候选基因。本研究中，从食管鳞癌细胞株TE-1构建食管鳞癌顺铂耐药细胞株TE-1/DDP，并对TE-1细胞和TE-1/DDP细胞的lncRNA和mRNA进行二代测序分析，寻找到TE-1/DDP顺铂耐药相关的mRNA为核因子E2相关因子2(nuclear factor E2-related factor2，Nrf2)，相关的lncRNA为lncCOPZ2-1，lncCOPZ2-1位于17号染色体。Nrf2是属于cap'n'亮氨酸拉链(b-ZIP)蛋白家族，作为转录因子的Nrf2可以促进细胞生长，并且研究发现Nrf2及其转录靶基因在肿瘤发生中的潜在作用，并且跟食管鳞癌的放化疗效果在一定程度上存在负相关。目前，有少数关于肿瘤中lncRNAs和Nrf2的互作关系的献报道。在吸烟相关肺癌的细胞系中，发现了位于5号染色体上名为SCAL1(smoke and cancer-associated lncRNA-1)的lncRNA，其转录调控受到Nrf2的制约;在胆囊癌中lncRNA NmrA-like家族结构域包含一个假基因(Loc344887)，Loc344887的表达上调与Nrf2高表达密切相关，Loc344887高表达对上皮细胞间质化有促进作用，因此亦有可能成为胆囊癌治疗的靶点。<br>　　因此，我们构建Nrf2过表达食管鳞癌细胞株，观察顺铂压力下Nrf2过表达对食管鳞癌细胞生物活性的影响。检测沉默和过表达lncCOPZ2-1对Nrf2表达水平的影响，并通过裸鼠荷瘤实验检测lncCOPZ2-1过表达在活体内对食管鳞癌细胞顺铂耐药性的影响。这样，通过体内外实验了解lncCOPZ2-1调节Nrf2参与食管鳞癌顺铂化疗耐药的机制，为逆转食管鳞癌顺铂耐药药物的研发提供依据。<br>　　研究目的：<br>　　研究人食管鳞癌TE-1细胞株和TE-1/DDP细胞株差异性表达的mRNA和lncRNA，发现Nrf2和lncCOPZ2-1上调与TE-1/DDP细胞株顺铂耐药密切相关。进一步研究Nrf2表达水平导致TE-1/DDP顺铂耐药的生物学机制;研究lncCOPZ2-1表达水平对Nrf2基因表达水平及下游信号通路蛋白的影响;研究过表达lncCOPZ2-1在体外实验观察TE-1/DDP细胞顺铂耐药性。探索lncCOPZ2-1介导Nrf2导致TE-1/DDP细胞株顺铂耐药的机制，为药物研发提供理论基础和实验依据。<br>　　研究方法：<br>　　本研究所使用的研究方法包括:人食管鳞癌TE-1细胞株和TE-1/DDP细胞株、二代测序、CCK8实验、Transwell侵袭实验、细胞内活性氧检测、流式细胞术、克隆形成实验、基因转染与敲除、荧光定量PCR、蛋白免疫印迹、免疫组织化学技术、裸鼠成瘤实验等。<br>　　研究内容：<br>　　1.对人食管鳞癌TE-1和TE-1/DDP细胞株lncRNA和mRNA进行二代测序分析，筛选出与TE-1/DDP细胞株顺铂耐药密切相关的mRNA为Nrf2、lncRNA为lncCOPZ2-1。<br>　　2.研究过表达Nrf2基因对人食管鳞癌TE-1细胞生物学活性的影响，及食管鳞癌组织中Nrf2蛋白表达水平与患者预后的关系。<br>　　3.通过体内外实验研究lncCOPZ2-1是否可以介导Nrf2导致TE-1/DDP细胞株顺铂耐药。<br>　　研究结果:<br>　　1.对TE-1细胞和TE-1/DDP细胞的lncRNA和mRNA进行二代测序分析，发现Nrf2基因在人食管鳞癌耐药TE-1/DDP细胞株中高表达。<br>　　2.与Nrf2基因相关的前10位高表达的lncRNA中，lncCOPZ2-1在人食管鳞癌耐药细胞株TE-1/DDP细胞中也高表达。Nrf2的高表达与食管鳞癌患者的预后不良有关。Nrf2高表达能促进TE-1/DDP细胞的细胞活力、增殖能力、克细胞隆形成能力，同时可以抑制TE-1/DDP细胞凋亡和ROS水平。<br>　　3.lnc COPZ2-1过表达可以促进TE-1/DDP细胞中Nrf2在mRNA和蛋白水平的表达。<br>　　4.lnc COPZ2-1过表达可以促进TE-1/DDP细胞中Nrf2-ARE抗氧化通路相关基因(HO-1、NQO1、XCT)基因的表达，激活Nrf2-ARE抗氧化通路。Nrf2过表达抑制cCASP3和Bax的表达，促进Bcl2的表达，即Nrf2过表达抑制食管癌细胞的凋亡。<br>　　5.在体内实验中，过表达lncCOPZ2-1能够显著地提升TE-1/DDP细胞对顺铂化疗耐药性。<br>　　本研究主要结论和科学意义:<br>　　1.本研究发现lncCOPZ2-1和Nrf2与TE-1/DDP细胞株顺铂耐药性有相关性，其潜在的互相作用关系值得进一步研究。<br>　　2.本研究发现在顺铂压力下，Nrf2高表达可以促进TE-1细胞活力、抑制细胞凋亡、促进细胞克隆形成能力。<br>　　3.通过体内和体外实验发现lnc COPZ2-1可以正向调节Nrf2，导致TE-1/DDP细胞株对顺铂化疗耐药，为药物研发提供理论基础和实验依据。<br>　　本研究的创新之处:<br>　　1.本研究的创新性在于，发现了过表达的lncCOPZ2-1上调Nrf2的表达水平，与食管鳞癌对DDP化疗产生耐药性相关，部分解释了食管鳞癌DDP耐药的分子生物学原因。<br>　　2.本研究预测lncCOPZ2-1可以作为DDP耐药的筛选指标，同时为扭转DDP耐药研究提供切入点。<br>　　本研究的不足之处:<br>　　1.本研究中只发现lncCOPZ2-1与Nrf2的线性调节关系，但是lncCOPZ2-1作用于Nrf2的具体分子生物学机制需进一步实验研究和探索。<br>　　2.食管鳞癌DDP耐药有多因素、多基因参与，仍需要大量实验研究深入了解DDP耐药的网络调节机制。<br>　　进一步研究计划:<br>　　1.进一步通过lncRNA所具有的分子生物学功能，设计实验方法，从分子学水平研究lnc COPZ2-1作用于Nrf2的分子生物学机制和潜在信号通路。<br>　　2.进一步补充实验的样本量，筛选出与食管鳞癌顺铂耐药密切相关的lncRNA和mRNA，由点及面的研究两者相互作用的网络调节机制。