检索历史 清除

摘要本文主要从以下几个部分展开论述：<br>　　第一部分:BNC1基因新发突变的初步功能研究<br>　　目的:对从人卵巢功能不全患者中鉴定的新致病基因突变进行突变基因的初步功能研究。<br>　　材料与方法:收集人卵细胞和卵巢组织、小鼠卵细胞和卵巢组织等，通过免疫荧光、RT-qPCR等方法检测BNC1在人和小鼠的卵细胞及卵巢组织中的表达情况。构建BNC1野生型和突变型（包括遗传性卵巢功能不全家系中发现的BNC1基因截短突变和在散发性卵巢功能不全患者中发现的BNC1基因点突变）载体行体外转染后通过荧光显微镜观察BNC1蛋白定位。通过小干扰RNA技术构建敲减人卵母细胞BNC1含量的细胞模型，研究BNC1敲减对人卵母细胞发育的影响。通过化疗药物构建外源性因素致卵巢功能不全小鼠模型，检测卵巢中Bnc1表达量的改变。<br>　　结果:免疫荧光检测发现BNC1蛋白表达于人卵巢组织中，尤其表达在卵子中。RT-qPCR显示BNC1基因表达于小鼠卵子、卵巢、睾丸中，且在卵子中表达量最高。在荧光显微镜下观察野生型BNC1蛋白及突变型BNC1蛋白定位发现野生型BNC1蛋白主要位于细胞核中，突变型BNC1蛋白入核障碍。人MⅠ期卵子进行BNC1敲减后，其卵子退化比例较对照组显著升高，第一极体排出率和成熟为MⅡ期卵子率均显著降低;卵子内BMP15和p-AKT表达量显著下调。阿霉素致卵巢功能不全小鼠模型中，小鼠卵巢内Bnc1表达显著降低。<br>　　结论:BNC1基因突变可能与卵巢功能不全有关，这一研究发现既往未见报道，是全新的卵巢功能不全致病基因突变。BNC1突变或缺失可导致蛋白入核障碍和卵子减数分裂异常。<br>　　第二部分:BNC1基因新发突变致卵巢功能不全发生的动物模型表型研究<br>　　目的:通过构建Bnc1基因突变动物模型，探究Bnc1基因新发突变致卵巢功能不全发生的效应。<br>　　材料与方法:构建携带Bnc1截短突变基因型的小鼠，分别在不同时间点收集野生型（Bnc1+/+）、杂合型（Bnc1+/tr）、纯合型（Bnc1tr/tr）小鼠血液、卵巢组织。通过免疫组化对卵巢中的Bnc1蛋白表达进行定位和定量分析。分别观察野生型、杂合型、纯合型小鼠模型生长曲线变化、生育力情况、动情周期、卵巢大体形态和重量（与体重比值）。分别取三组小鼠不同周龄血清通过放射性免疫法测定生殖激素(FSH，LH，E2)水平，明确其随年龄增长生殖内分泌的变化情况。通过比较分析三组小鼠的卵巢切片并进行卵泡计数，探究Bnc1截短突变对卵母细胞发育各阶段细胞（始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡）的数量、分布情况、所占比例的影响，并探讨Bnc1截短突变是否具有剂量效应。通过透射电镜观察三组小鼠卵巢内卵母细胞亚细胞结构改变情况。<br>　　结果:纯合型小鼠卵巢Bnc1蛋白表达量较野生型小鼠卵巢Bnc1蛋白表达量显著减少。野生型、杂合型小鼠在各周龄的体重无显著性差异。杂合型小鼠生育力显著降低，表现为每窝产仔数显著减少，纯合型小鼠表现为不孕。杂合小鼠的卵巢体积及卵巢/体重比显著小于野生型，纯合型的卵巢体积及卵巢/体重比显著小于杂合型和野生型。36周龄杂合型小鼠较野生型小鼠，其血清E2水平显著降低、FSH显著升高、LH显著升高;36周龄纯合型小鼠较杂合型和野生型小鼠，其血清E2水平显著降低、FSH显著升高、LH显著升高。Bnc1截短突变小鼠的动情周期发生改变，主要表现为动情前期缩短，动情后期显著延长。杂合型小鼠 的始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡均分别显著少于野生型，纯合型小鼠的始基卵泡、初级卵泡、次级卵泡、窦卵泡均分别显著少于杂合型和野生型。三组基因型小鼠卵巢的透明带，颗粒细胞，卵子内线粒体、内质网、高尔基体、核糖体等细胞器均未发现形态结构上明显差异，但Bnc1截短突变纯合型卵巢卵子内脂滴明显沉积，显著多于杂合型和野生型。<br>　　结论:Bnc1突变导致小鼠生育力降低，动情周期改变，FSH显著增高，E2显著降低，卵巢提前萎缩，各级卵泡数目显著减少，卵母细胞内发生明显的脂滴沉积，发生卵巢功能不全。<br>　　第三部分:BNC1基因致卵巢功能不全发生的分子机制研究<br>　　目的:探讨Bnc1基因突变致卵母细胞发生发育异常及卵巢功能不全发生的分子机制。<br>　　材料与方法:通过8周龄野生型及Bnc1截短突变的纯合小鼠卵巢基因表达谱RNA-seq分析，明确Bnc1基因突变导致小鼠生殖细胞发生表达改变的基因。通过生物信息学分析对转录组学研究中的差异基因进行Go分析、Pathway分析、基因互作网络分析、基因共表达网络分析，明确可能的上下游调控基因。RT-qPCR验证相关基因差异表达。通过对小鼠卵巢组织行染色质免疫共沉淀测序(ChIP-seq)实验挖掘Bnc1直接作用的下游基因。通过RNA-seq和ChIP-seq联合分析筛选可能的下游靶分子并进行染色质免疫共沉淀验证。<br>　　结果:以Fold change＞2，FDR＜0.05为基因差异表达标准，发现8周龄Bnc1截短突变的纯合小鼠卵巢较野生型小鼠卵巢有232个基因表达上调，291个基因表达下调。通过进一步对差异基因进行功能Go显著性分析发现差异基因主要参与脂质代谢、胆固醇代谢、甾体激素代谢、细胞分化等生物过程。通过对差异基因进行信号通路Pathway显著性分析亦发现差异基因主要参与的是脂质合成、卵巢类固醇激素合成、脂肪消化和吸收等信号通路。ChIP-seq检测到Bnc1直接参与调控的1323个peak related基因。将转录组获得的523个差异表达基因、Bnc1+/+/Bnc1tr/tr小鼠卵巢基因共表达网络关系，与ChIP-seq获得的1323个peak related基因联合分析，获得20个重合基因，如Scarb1、Itpr2、Slc5a8基因等。进一步结合文献阅读、ChIP验证和qPCR验证证实Bnc1蛋白能与Scarb1基因序列结合，并调控Scarb1基因的表达。<br>　　结论:Bnc1截短突变致Scarb1基因表达显著减少可能是导致其发生卵子中脂滴增多聚集、卵子发生发育异常、生育力降低、卵巢功能不全的原因。