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摘要本论文包含三部分内容。第一部分是关于人源MARS复合物的电镜结构研究。氨基酰-tRNA合成酶(Aminoacyl-tRNA synthetases，aaRS)是一类特异催化tRNA氨基酰化的蛋白质酶，对mRNA上遗传信息的准确传递有重要作用。在进化过程中，一些aaRS的N端或C端获得附加结构，同时相互结合形成多酶复合物MARS(Multiaminoacyl-tRNA synthetase complex)。人源MARS复合物由9种合成酶(EPRS、IRS、LRS、MRS、QRS、KRS、RRS、DRS)和3种辅助蛋白质因子(P43、P38、P18)组成。一方面MARS复合物的形成提高tRNA氨基酰化效率，保证了蛋白质合成的高效运行。另一方面MARS复合物的组分在某些外界刺激下会解离下来参与广泛的细胞调控过程。MARS复合物作为可释放aaRS的仓库，如何将多种aaRS和辅助蛋白质因子有序地组装？如何协调催化功能和其他细胞调控功能？对于这些问题的解答，其中MARS复合物高分辨率结构的解析是必不可少的。我们通过哺乳细胞慢病毒表达系统纯化出人源MARS复合物，经过一些纯化策略将其转化为良好的电镜样品，同时利用负染电镜技术重构出低分辨率的三维模型。目前我们对这个复合物的性质和形态都有了一定的了解，并且已摸索出较合适的冷冻电镜制样条件。下一步我们将重点进行冷冻样品制备条件的优化和高质量冷冻数据的收集与处理，期望解析出完整复合物的高分辨率的结构，描绘出MARS的组装过程以及内部亚基之间真实的相互作用网络。<br>　　第二部分是关于人源RNase P复合物的纯化和电镜结构研究。RNase P复合物是一类催化加工pre-tRNA的5'端成熟的核酶，它存在于几乎所有生命体中。在细菌中RNase P复合物包含一个大的RNA亚基和一个小的蛋白质亚基，其中RNA亚基主要负责识别和催化切割pre-tRNA。与RNA亚基在结构和功能上的保守性相反，蛋白质亚基在古细菌和真核生物中变得越来越复杂。这些多蛋白质亚基的形成对其RNA亚基的稳定和催化活性的影响不尽相同。人源RNase P复合物的组分很早就被鉴定出来，包括10个蛋白质亚基(hPOP1、hPOP5、RPP40、RPP38、RPP30、RPP29、RPP25、RPP21、RPP20、RPP14)和一个RNA亚基(H1RNA)，其中有9个在酵母中存在同源蛋白。<br>　　长久以来，人源RNase P复合物样品的获取主要通过两种方式，一种是体外表达复合物中的蛋白质组分，并重组出具有活性的亚复合物，但是这种mini-RNase P不具有结构均一性。另一种方式是内源提取Hela细胞的RNase P复合物，然而样品的纯度和产量无法进一步做结构生物学研究。因此如何获得结构上稳定均一的RNase P全酶样品一直是个挑战。<br>　　本实验中我们建立了特有的哺乳细胞慢病毒表达系统，利用双亲和标签从内源提取出RNase P复合物，通过质谱技术和QPCR技术分别鉴定到所有已知的蛋白质组分和RNA组分。结合活性实验结果证明我们得到了高纯度，有活性，组分完整，状态均一的RNase P复合物。随后利用电镜技术首次得到了人源RNaseP全酶的负染三维重构模型。与酵母RNase P的负染三维结构比较，两者在整体结构的轮廓上很相近。我们推测人源RNase P中亚基的相对位置和酵母中同源蛋白的相对位置可能是一样的。同时我们也观察到两者结构的几处不同。这也体现了它们RNA亚基的差异和非同源蛋白质亚基对复合物组装的影响。只有提高结构的分辨率，我们才能了解清楚RNA复杂的三维空间构象以及RNA-蛋白质、蛋白质-蛋白质的相互作用和相对位置。接下来我们将重点摸索RNase P低温冷冻电镜制样条件，解析出全酶的高分辨率结构。<br>　　第三部分是人源RPP40的晶体结构研究。人源RNase P复合物中已鉴定的10个蛋白质亚基，除了RPP40，在酵母中均存在同源蛋白。在进化中，RNase P复合物招募了越来越多的蛋白质亚基，但这些亚基的作用与功能并不十分清楚。RPP40是RNase P复合物进化中出现的全新组分，可能其结构上存在一定特殊性。我们利用大肠杆菌表达系统纯化得到了状态均一、性质良好的RPP40蛋白质，并解析出精细的晶体结构。这种结构如何参与复合物的组装和底物识别，仍需要进一步高分辨率结构的解析。同时RPP40的晶体结构解析也为后续RNase P全酶的冷冻电镜模型搭建提供便利。