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摘要一、研究目的<br>　　肾癌是常见的恶性肿瘤，占成人恶性肿瘤的2-3％，是少数几个全球范围内发病率逐年上升的肿瘤之一。但是肾癌面临早期诊断困难以及治疗效果差等治疗现状，由于肾癌起病隐匿，早期没有明显典型的临床症状，因此大约20-30％的患者在确诊肾癌的时候就已经发生转移。除了手术之外，其他的治疗方法如白介素2或干扰素α并没有明显的临床效果，而且由于其严重的副作用使得患者的生活质量大打折扣。所以，新的治疗方法即靶向治疗应运而生，以舒尼替尼为代表的受体酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinase inhibitors，TKI)是目前治疗进展期肾癌的一线治疗方案。舒尼替尼(Sunitinib)作为一个多靶点的酪氨酸激酶抑制剂，同时具有抑制肿瘤新生血管形成和抑制肿瘤细胞自身的作用。尽管小分子靶向药物极大改善了晚期肾癌的治疗前景，但随着药物的应用，耐药逐渐降低了靶向药物的临床效果。约有20％左右的患者在初次服用舒尼替尼时即会表现出先天耐药，而大部分患者在使用舒尼替尼治疗6-11个月后便会出现继发耐药。目前有关肾癌舒尼替尼耐药发生的分子生物学机制尚不明确，也缺少有效的生物学标志物来预测肾癌舒尼替尼的耐药以及缺少有效的治疗方法逆转或者延缓耐药。因此，探索肾癌舒尼替尼耐药发生的分子生物学机制以及探寻能够有效预测舒尼替尼疗效的分子标志物十分必要。<br>　　DNA甲基化是一种常见的表观遗传修饰，是在DNA甲基转移酶(DNMT)的作用下，由S-腺苷甲硫氨酸(SAM)作为甲基供体，在胞嘧啶环的5碳上添加甲基，转变为5-甲基胞嘧啶(mC)，常发生于CpG岛，而CpG岛一般位于基因的启动子区域，含有很多转录因子的结合位点，此区域的甲基化往往与基因转录密切相关，与肿瘤、胚胎发育、衰老等许多疾病及生理过程密切相关。<br>　　因此，本课题的研究目的是探索DNA甲基化改变是否在肾癌舒尼替尼原发性耐药中发挥作用，以及DNA的甲基化是否能够作为诊断肾癌舒尼替尼原发性耐药的分子标志物，从而为治疗肾癌舒尼替尼耐药寻找新的靶点，进一步提高肾癌靶向治疗的效果，提高患者生活质量及延长患者总生存期提供新的依据。<br>　　二、研究方法<br>　　1、选用Illumina Human850k甲基化芯片对肾癌舒尼替尼原发性耐药与敏感组织标本(4∶4)进行检测，筛选出差异的甲基化位点后，选取肾癌舒尼替尼原发性耐药与敏感组织标本(10∶10)，利用Sequenom Methylation质谱检测对甲基化芯片结果进行扩大样本验证。<br>　　2、通过qPCR、Westem blot、免疫组化、Elisa等实验方法，检测QPCT在肾癌舒尼替尼原发性耐药与敏感患者的组织与血浆中含量是否有明显差异。利用156例肾癌患者组织构建的组织芯片检测QPCT表达量，根据随访数据，分析QPCT与患者预后及舒尼替尼反应性的关系。<br>　　3、体外功能实验验证QPCT在肾癌舒尼替尼耐药中的作用:使用siRNA瞬时转染肾癌细胞敲低QPCT及利用慢病毒转染肾癌细胞稳定过表达QPCT后，运用CCK-8增殖实验、克隆形成实验、流式检测细胞凋亡来判定肾癌细胞对舒尼替尼的敏感性是否发生变化。<br>　　4、体内实验验证QPCT在肾癌舒尼替尼耐药中的作用:行裸鼠皮下荷瘤，模拟临床给药，使用舒尼替尼40mg/kg/day（实验组）和生理盐水（对照组）进行灌胃处理，每五天测量一次移植瘤大小，记录数据，绘制肿瘤生长曲线。<br>　　5、使用5-Aza-2'-deoxycytidine(Decitabine)抑制DNA甲基化转移酶后验证QPCT启动子区域的甲基化改变是否影响其表达;利用ChIP实验验证NF-κB(p65)与QPCT启动子区域是否结合，并且研究QPCT启动子区域甲基化程度的高低是否会影响NF-κB(p65)结合。<br>　　6、使用人类蛋白组芯片检测可能与QPCT结合的蛋白，对蛋白芯片结果进行筛选，在肾癌细胞中，应用蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)和激光共聚焦实验，验证蛋白芯片结果，并找到与QPCT相互结合的蛋白HRAS。在肾癌组织芯片及肾癌细胞中，验证HRAS与肾癌舒尼替尼耐药的关系及其在肾癌舒尼替尼耐药中发挥的作用。运用“Rescue实验”，进一步明确QPCT是否通过HRAS影响肾癌细胞对舒尼替尼的敏感性，并且探索其介导肾癌舒尼替尼耐药发生的具体机制。<br>　　三、研究结果<br>　　1、通过甲基化芯片，初筛出9个基因及甲基化差异位点，IRS1、SKI、PTK2B、QPCT、Clorf86、B3GNT7、AP4K2、PRKCZ、ACP5。<br>　　2、利用Sequenom Methylation扩大样本验证甲基化芯片结果，发现IRS1、SKI、PTK2B、QPCT甲基化改变在肾癌舒尼替尼原发性耐药与敏感组织中有明显差异。<br>　　3、通过在实时定量PCR和Western blot，发现在mRNA水平，QPCT和IRS1在肾癌舒尼替尼原发性耐药与敏感组织中表达有明显差异;但在蛋白水平，QPCT在肾癌舒尼替尼原发性耐药与敏感组织中表达有明显差异，IRS1在肾癌舒尼替尼耐药与敏感组织中表达没有明显差异。使用免疫组化方法确定QPCT在肾癌舒尼替尼原发性耐药与敏感组织中表达有明显差异。Elisa实验发现QPCT在肾癌舒尼替尼原发性耐药与敏感患者的外周血（血浆）中含量有明显差异。通过组织芯片及随访资料证实，在肾癌组织中高表达QPCT时，患者对舒尼替尼的反应性较差，治疗效果较差。<br>　　4、体外实验发现敲低QPCT可以促进肾癌细胞对舒尼替尼的敏感性，过表达QPCT可以促进肾癌细胞对舒尼替尼的耐药性，体内实验证明过表达QPCT的肾癌移植瘤在舒尼替尼作用下生长比对照组更快，说明过表达QPCT可以导致肾癌细胞舒尼替尼耐药。<br>　　5、通过Decitabine抑制QPCT启动子区域甲基化后，QPCT表达增加，说明QPCT启动子区域甲基化程度的改变可以影响QPCT的表达。<br>　　6、NF-κB(p65)在肾癌舒尼替尼耐药组织中高表达，通过ChIP实验证明NF-κB(p65)与QPCT启动子区域结合，并且抑制QPCT启动子区域甲基化可以促进NF-κB(p65)的结合，NF-κB(p65)可以促进QPCT的表达。<br>　　7、通过人类蛋白组芯片共检测出355个可能与QPCT结合的蛋白。筛选出7个目标蛋白:PTK2，HRAS，CBL，GAB1，NAF1，MAPK8，MAPK10。在肾癌细胞中，通过蛋白质免疫共沉淀(Co-IP)和激光共聚焦实验，证实QPCT与HRAS相互结合，确定HRAS为QPCT的下游作用蛋白，并且发现过表达HRAS可以促进肾癌细胞对舒尼替尼的耐药性，敲低HRAS可以促进肾癌细胞对舒尼替尼的敏感性。通过放线菌酮实验以及泛素化检测，发现QPCT与HRAS结合，可以增加HRAS的稳定性，减少其泛素化降解。<br>　　8、利用“Rescue实验”，证明QPCT是通过HRAS影响肾癌细胞对舒尼替尼敏感性，并且HRAS通过激活ERK信号通路，导致肾癌舒尼替尼耐药。<br>　　四、研究结论<br>　　QPCT启动子区域甲基化水平在肾癌舒尼替尼原发性耐药组织中低于肾癌舒尼替尼敏感组织，QPCT在肾癌舒尼替尼原发性耐药的组织中高表达，并且原发性耐药患者的外周血（血浆）中QPCT含量也较敏感患者升高。体内外功能实验证明过表达QPCT可以导致肾癌舒尼替尼耐药，敲低QPCT可以促进肾癌细胞对舒尼替尼敏感性。通过Decitabine抑制QPCT启动子区域甲基化后，QPCT表达增加。ChIP实验证明NF-κB(p65)与QPCT启动子区域结合，抑制QPCT启动子区域甲基化可以促进NF-κB(p65)的结合。NF-κB(p65)在肾癌舒尼替尼耐药组织中高表达，并且NF-κB(p65)可以促进QPCT的表达。通过人类蛋白组芯片发现QPCT与HRAS相互结合，QPCT可以增加HRAS的稳定性，减少其泛素化降解，HRAS通过促进ERK磷酸化，激活ERK信号通路导致肾癌舒尼替尼耐药的发生。<br>　　因此，QPCT启动子区域的甲基化程度及QPCT的表达水平可以作为预测肾癌舒尼替尼敏感性的生物学标志物，QPCT及HRAS也有望成为逆转肾癌舒尼替尼耐药发生的治疗新靶点，进一步提高肾癌靶向治疗的效果。