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摘要Peutz-Jeghers综合征(Peutz-Jeghers Syndrome PJS)，又称黑斑息肉综合征，于1921年及1949年分别由Peutz及Jeghers首次提出。PJ综合征是一种相当罕见的常染色体显性遗传性疾病，临床主要表现为布满消化道的息肉，皮肤色素沉着及具有家族遗传史。临床总体发病率为1/8300-1/200000。<br>　　丝苏氨酸蛋白激酶11基因（serine threonine protein kinase11，STK11）又叫肝激酶B1(live kinase B1LKB1).目前，STK11基因突变被认为是PJ综合征的主要致病因素。文献报道中，60-70％的PJ综合征患者伴有STK11基因的突变。纳入的病例数均较少。且STK11突变在PJ综合征中具体的作用机制尚未阐明。<br>　　肠道微生态对于消化道功能及人体的正常代谢具有重要的作用。目前文献报道已证实肠道微生态紊乱与多种消化道疾病有关，包括坏死性结肠炎，结肠癌，克罗恩病，溃疡性结肠炎等。PJ综合征患者中肠道菌群的分布情况尚无报道，STK11突变对肠道微生态的影响尚未可知。<br>　　错构瘤型息肉可出现于消化道的任何部位，以小肠最为多见，结肠次之。PJ综合征患者中消化道出血，肠梗阻及肠套叠的风险明显增高。此外，PJ息肉的癌变风险较正常息肉明显增高。因此，息肉的切除具有相当重要的临床意义。既往多采用手术治疗，患者反复因肠套叠，肠梗阻住院行手术切除息肉相应肠段。自双气囊小肠镜(DBE)问世以来，其已被广泛的应用于消化道息肉的切除。但由于PJ综合征发病率低，双气囊小肠镜在PJ综合征中的应用价值报道较少，均为小样本报道。<br>　　因此，通过应用二代测序明确STK11基因突变率，进一步阐释STK11/LKB1-AMPK-mTOR通路在PJ综合征中的作用机制，并明确PJ综合征患者中肠道菌群的分布特征，总结PJ综合征患者的临床特征及与STK11基因突变的相关性，旨在为临床提供治疗基础。<br>　　第一部分 Peutz-Jeghers综合征中STK11/LKB1及结直肠癌相关基因突变率检测<br>　　目的:STK11基因突变为PJ综合征的主要致病因素，PJ综合征患者结直肠癌的发病率明显增高。本研究旨在于明确STK11基因及遗传性结直肠癌相关基因的突变率。<br>　　方法:①标本收集收集本院2013年6月至2018年12月65例Peutz-Jeghers综合征患者及85例健康志愿者血液标本及临床资料。②采用包含16个结直肠癌的panel进行二代基因测序，对于已检测到的突变位点行一代测序（sanger测序法）进行验证，对于未发现突变位点的患者进一步行MLPA检测。③将检测到的基因进行KEGG富集，分析相关通路的基因变化。<br>　　结果:65例患者中，7例患者未检查到任何基因突变。43例(66.2％)患者出现28个位点的STK11基因突变，18例(28％)患者出现5个位点PTEN基因突变，17例(25％)患者出现9个位点MSH2突变，12例(18％)患者出现4个位点EPCAM基因突变，8例患者(12％)出现6个位点MLH3基因突变。7例患者(11％)出现1个位点MLH1基因突变。KEGG富集分析表明，PJ综合征患者突变基因主要涉及DNA错配修复，子宫内膜癌及结直肠癌信号通路。共检测到的28个STK11突变位点中，23个位于外显子区，5个位于剪接区。34.6％的患者突变分布于第6号和第8号染色体。突变位点最常见于第4号和6号染色体。共发现9个尚未报到的突变位点。包括剪接位点突变:c.464+1G＞A，c.862+1G＞A;非同义突变:c.T482G，c.G716C，c.T922C;无义突变:c.C783G，c.C816A;插入突变:c.385dupA，缺失突变:c.397delG。未检测到STK11点突变的患者中，7例患者检测到大片段缺失，检出率为31.8％，占总体检出率10.8％。<br>　　结论:PJ综合征中遗传性结直肠癌相关基因，包括STK11，PTEN，MSH2，EPCAM，MLH3，MLH1突变率增加，主要涉及DNA错配修复，子宫内膜癌及结直肠癌通路。STK11基因总体突变率为76.9％，66.2％为点突变，10.8％为大片段缺失。<br>　　第二部分 STK11-AMPK-mTOR通路在Peutz-Jeghers综合征中的作用机制研究<br>　　目的:探讨STK11-AMPK-mTOR通路在Peutz-Jeghers综合征中的作用，为阐明Peutz-Jeghers综合征的发病机制奠定实验基础。<br>　　方法:(1)标本收集收集2013年6月至2018年12月我院消化内科及普外科的手术切除标本。以30例确诊为Peutz-Jeghers综合征患者并伴有STK11突变的息肉标本为病例组，30例肠道癌旁正常黏膜标本为对照组。(2)采用免疫组织化学染色法及蛋白印迹方法比较伴有STK11基因突变Peutz-Jeghers综合征患者及肠道正常黏膜组织STK11，pAMPK，pmTOR蛋白的表达情况。<br>　　结果:正常癌旁组织中，LKB1蛋白阳性的表达率83.3％，明显高于PJ综合征患者(83.3％ vs 13.3，P＜0.001)。pAMPK蛋白阳性表达率73.3％，明显高于PJ综合征患者(76.7％ vs 20％，P＜0.001)，而pmTOR蛋白则相反，癌旁组织阳性率明显低于PJ综合征患者(33.3％ vs 76.7，P=0.001)。WB结果与IHC结果一致，PJ综合征患者息肉组织中LKB1，pAMPK蛋白含量明显降低，pmTOR蛋白含量增高。<br>　　结论:本研究结果证实，LKB1/AMPK/mTOR信号转导通路在PJ综合征发生及发展中发挥重要作用，可成为PJ综合征患者治疗的新靶点。<br>　　第三部分 STK11基因突变对Peutz-Jeghers综合征肠道菌群的影响研究<br>　　目的:探索PJ综合征患者肠道菌群的组成特征及STK11基因突变对肠道菌群的影响。<br>　　方法:以2017年1月至2018年6月就诊于我院确诊的32例PJ综合征患者为病例组（P组），首选其配偶为对照组，若无配偶，则按照年龄随机匹配一健康志愿者（就诊于我院体检中心）（H组），共纳入健康志愿者35例，收集病例组及对照组的新鲜粪便标本，提取DNA并采用16S测序法（V3-V4区），比较两组菌群组成的差异。收集患者的血液，提取血液DNA进行二代测序，根据是否伴有STK11基因突变，将PJ综合征患者分为突变组（Y组）和未突变组（N组），比较两组菌群组成的差异。<br>　　结果:PJ综合征患者与健康人群相比，两组中α多样性包括Observed species指数、Cha01指数、Shannon指数及Simpson指数无明显统计学差异。物种Anosim分析结果显示:加权unifrac，P=0.001;非加权unifrac，P=0.004，提示物种的组成明显的统计学差异;PCoA分析结果显示:两组物种具有明显的聚类现象。物种差异性结果显示，Proteobacteria(LDA=4.84，P＜ 0.001)， Gammaproteobacteria(LDA=4.91, P＜ 0.001),Aeromonadaceae (LDA=3.54, P=0.026), Actinomycetaceae(LDA=3.94, P=0.04),Morganella(LDA=3.71,P＜0.001),Proteus(LDA=2.83,P=0.003)等在P组丰度明显大于H组。Bacteroidetes(LDA=5.01,P＜0.001)，Betaproteobacteria, Bacteroidales, Clostridium Ⅺ (LDA=3.52,P＜0.001),Clostridium (ⅩⅧ) (LDA=2.97，P＜0.001)等则P组丰度明显小于H组。Stamp分析KEGG差异通路显示:两组患者共有29种代谢途径相关基因发生显著变化。Y组与N组相比，α多样性明显下降。物种Anosim分析及PCoA分析提示两组的物种组成无明显统计学差异。Stamp分析KEGG差异通路显示:两组患者共有8种代谢途径相关基因发生显著变化。摩根氏菌属与空肠息肉数量呈正相关，Anaerostipes及梭菌属与空肠息肉数量呈负相关。摩根氏菌属及脱硫孤菌属与空肠息肉数量增长速速呈正相关，Anaerostipes与空肠息肉数量增长速度呈负相关。脱硫孤菌属，Anaerostipes及Fusicatenibacter与空肠息肉大小呈负相关。<br>　　结论:PJ综合征患者肠道菌群发生了明显的变化，STK11突变可影响肠道菌群的多样性。由肠道菌群的改变导致了体内代谢通路相关基因的改变，进而对PJ综合征患者临床表现产生深远的影响。