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摘要子痫前期(Preeclampsia，PE)是妊娠期特发性疾病，是指在妊娠的中晚期出现高血压和蛋白尿症状，并且可能并发肾功能衰竭、肝功能失调和神经系统性临床表现比如癫痫等并发症。PE是引起母亲和胎儿发病率和死亡率增高的主要原因之一，可能造成早产和胎儿宫内生长受限。这种妊娠期并发症的发生受到遗传和环境因素的共同影响。目前PE确切的病因学并不清楚，其发生是多种病因作用的结果，这些病因包括子宫螺旋动脉重铸障碍、胎盘氧化应激、血管内皮细胞功能紊乱和异常的母体炎症反应。PE直到妊娠晚期才能得到诊断，因此有必要寻找合适的生物学标志物对PE进行早期诊断，进而采取相应的治疗措施。<br>　　不引起基因序列改变的DNA表观遗传学改变被证实和多种疾病相关。DNA表观遗传改变具有可遗传性，受到环境因素的影响，能够改变人类对多种疾病的易感性。DNA甲基化是表观遗传机制的一种，研究发现DNA甲基化水平异常和胎盘滋养层中的多种病理过程相关，比如胎盘血管生成异常。研究发现PE尤其是早发型PE（early-onset preeclampsia，EOPE）胎盘组织中出现多种基因的DNA甲基化水平改变，通过研究EOPE胎盘组织相关的DNA甲基化水平改变，探讨与这种疾病相关的表观遗传发病机制，并发现可能的表观遗传学标志物，为其早期诊断提供新的思路。<br>　　经典Wnt信号通路是一种高度保守的信号通路，并且在调节滋养层功能中起到关键作用。研究表明，Wnt信号通路异常活化和多种癌症发生相关。Wnt信号通路异常可能导致滋养层功能失调，进而参与PE的病理机制。目前已发表的关于Wnt信号通路与PE相关性的数据较少。<br>　　WNT2是一种经典Wnt信号通路配体，通过自分泌或者旁分泌方式发挥作用的一种糖蛋白。WNT2信号通路参与胚胎外发育，胎盘血管生成，绒毛膜尿囊融合等。研究表明PE胎盘组织中WNT2mRNA和WNT2蛋白表达显著降低，而WNT2基因启动子区域甲基化水平增高，推测WNT2基因启动子区域的高甲基化下调WNT2的表达。通过验证WNT2在单独EOPE胎盘组织中的甲基化和表达水平，研究WNT2甲基化和表达水平改变与EOPE发病可能的关联性。<br>　　DKK1是一种分泌蛋白，能抑制经典Wnt信号传导通路。DKK1和癌症的发生相关，在多种癌症中DKK1表达下调或者沉默。除此之外，DKK1表达异常与骨骼系统疾病、风湿病、糖尿病和阿尔茨海默病等相关。研究表明PE胎盘组织中DKK1mRNA和DKK1蛋白表达显著增高，可能通过抑制Wnt信号通路参与PE的发病。DKK1生PE胎盘组织表达异常的调节机制并不明确，其在EOPE胎盘组织中的甲基化水平与表达水平及两者之间的相关性未知。<br>　　目的：<br>　　本研究的目的是检测EOPE胎盘组织中WNT2和DKK1基因的DNA甲基化和转录水平及两者之间的相关性。该研究有助于了解EOPE的病理生理机制，为其早期诊断和治疗提供新的思路和方法。<br>　　方法：<br>　　1.研究对象与分组<br>　　研究对象分为三组：EOPE组（25例）、与EOPE组孕周差异无统计学意义的正常血压早产(preterm birth，PB)组（25例）和正常血压足月(term birth，TB)组（25例）。以PB和TB组为对照组，以EOPE组为实验组。<br>　　2.实验方法<br>　　2.1标本获取与保存胎盘组织在剖宫产后15分钟内获取。去除胎膜后，在胎盘母体面中央处表层5mm下剪取大小约为5×5×5mm胎盘绒毛组织多块。胎盘绒毛组织在冷的无菌PBS缓冲液中漂洗去除母体血和胎儿血。其中一部分胎盘绒毛组织直接保存于冻存管，备DNA抽提;另一部分保存于加有RNA保存液的冻存管，备RNA抽提。胎盘绒毛组织在液氮中速冻10分钟，然后保存于-80C冰箱备用。<br>　　2.2DNA提取和焦磷酸测序从60mg胎盘绒毛组织提取DNA，提取的DNA采用重亚硫酸盐进行转化，使未甲基化的胞嘧啶转化为尿嘧啶。评估WNT2和DKK1基因启动子区域用于进行焦磷酸测序的序列后，设计焦磷酸测序的引物，反向引物的5'末端采用生物素标记。检测WNT2基因目标序列中的7个CpG位点和DKK1基因目标序列中的5个CpG位点的甲基化水平。<br>　　2.3RNA提取和实时荧光定量PCR使用TRIzol试剂从80mg RNA保存液保存的胎盘绒毛组织提取RNA。使用反转录试剂盒将提取的RNA反转录为互补单链DNA(complementary DNA，cDNA)，设计WNT2和DKK1的实时荧光定量PCR引物，进行实时荧光定量PCR检测各个胎盘组织中的WNT2和DKK1mRNA的相对表达量。<br>　　3.统计学分析<br>　　本研究所得数据采用SPSS19.0软件进行统计学分析。对于定量资料，符合正态分布的数据以(x)±s表示其平均水平和变异程度，非正态分布的数据以中位数(M)描述其平均水平，以四分位数间距(P75-P25)描述其变异程度，使用单因素方差分析或者Kruskal-Wallis检验在三组之间进行比较，使用Bonferroni法进行两组数据之间的进一步的比较。使用Pearson相关分析或者Spearman秩相关分析用于分析两组变量的关联性。P＜0.05时，认为差异或者相关性分析具有统计学意义。<br>　　结果：<br>　　1.研究对象的临床参数<br>　　EOPE组、PB组和TB组分娩时孕周分别为33.91±1.39w、34.14±1.26w和38.48±0.88w，分别比较，TB组分娩时的孕周显著高于EOPE组(P＜0.05)和PB组（P＜0.05），并且TB组和EOPE组分娩时孕周的差异没有统计学意义。EOPE组、PB组和TB组的尿蛋白量分别为3.866±0.823g/24h、0.235±0.156g/24h和0.235±0.120g/24h，分别比较，EOPE组的尿蛋白量显著高于PB组（P＜0.05）和TB组(P＜0.05)，并且TB组和PB组尿蛋白量的差异不具有统计学意义。EOPE组、PB组和TB组的血压（收缩压/舒张压）分别为167.20±18.22/104.76±7.58mmHg、116.88±7.67/72.13±8.72mmHg、111.88±9.24/69.80±9.03mmHg，分别比较，EOPE组的血压显著高于PB组（P＜0.05）和TB组(P＜0.05)，而PB组和TB组血压的差异没有统计学意义。EOPE组、PB组和TB组的新生儿体重分别为1740.00±297.55g、2146.88±277.77g、3043.20±921.04g，分别比较，TB组的新生儿体重显著高于PB组(P＜0.05)和EOPE组(P＜0.05)，PB组的新生儿体重显著高于EOPE组（P＜0.05）。EOPE组、PB组和TB组的母亲年龄分别为29.92±6.24岁、31.06±5.25岁、29.52±4.30岁，分别比较，差异均不具有统计学意义。EOPE组、PB组和TB组的胎儿性别（男/女）分别为15/10、12/13、11/14，分别比较，差异均不具有统计学意义。<br>　　2.三组胎盘组织中WNT2和DKK1基因的的甲基化水平<br>　　PB组DKK1基因的CpG1、CpG2、CpG3和CpG4位点及平均甲基化水平均高于EOPE组和TB组，差异均有统计学意义(P＜0.05)，而EOPE组和TB组甲基化水平比较，差异无统计学意义。DKK1基因的CpG5在EOPE组胎盘组织均是非甲基化的，其甲基化水平显著低于PB组和TB组，而PB组和TB组的差异不具有统计学意义。三组之间WNT2基因的7个CpG位点及平均甲基化水平的差异均无统计学意义（P均＞0.05）。<br>　　3.三组胎盘组织中WNT2和DKK1mRNA的相对表达水平<br>　　EOPE组、TB组和PB组WNT2mRNA的相对表达量分别为1.25±0.77、4.61±1.87和4.64±1.68，分别比较，EOPE组WNT2mRNA的相对表达量显著低于TB组(P＜0.05)和PB组(P＜0.05)，而PB组和TB组之间的差异不具有统计学意义。EOPE组、TB组和PB组DKK1mRNA的相对表达量分别为3.46±1.34、4.01±1.85和1.14±0.60，分别比较，PB组DKK1mRNA的相对表达量显著低于EOPE组（P＜0.05）和TB组(P＜0.05)，而EOPE组和TB组的差异无统计学意义。在PB组和EOPE组，Pearson相关性分析显示WNT2mRNA的相对表达水平和DKK1mRNA的相对表达水平显著负相关（P＜0.05）。<br>　　4.DKK1和WNT2基因的甲基化和转录水平的相关性分析<br>　　WNT2mRNA的表达水平和WNT2的任何一个CpG位点的甲基化水平都没有显示显著相关性。在PB组、TB组和EOPE组，Pearson相关性分析显示DKK1mRNA的表达水平和DKK1的CpG2（r=-0.660，P＜0.05）与CpG4(r=-0.357，P＜0.05)的甲基化水平显著负相关，而与其它CpG位点的甲基化水平以及平均甲基化水平无显著相关性。<br>　　结论：<br>　　早发型子痫前期胎盘组织DKK1基因启动子区域的甲基化水平降低可能会上调DKK1的表达。DKK1的高表达和WNT2的低表达可能共同参与早发型子痫前期的病理。