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摘要本文从以下几个部分展开论述：<br>　　论文Ⅰ ADAM17基因干扰和过表达对糖尿病性心肌病的影响及机制研究<br>　　目的：<br>　　1.通过构建和转染ADAM17基因干扰和过表达腺病毒，探讨ADAM17基因干预对DCM小鼠心肌间质纤维化和左心功能的影响和机制研究。<br>　　2.通过构建1型糖尿病小鼠模型，探讨ADAM17基因干预能否调控DCM小鼠心肌ACE2、AT1R、AT2R和MasR的表达。<br>　　3.通过提取小鼠心脏成纤维细胞(CFs)，在体外实验中，探讨高糖刺激下ADAM17基因干预能否调控CFs细胞中ACE2、AT1R、AT2R和MasR的表达。<br>　　4.通过体内和体外实验，探讨ADAM17基因干预对肌成纤维细胞转分化的影响及分子机制。<br>　　方法：<br>　　1.糖尿病小鼠模型的建立和分组:<br>　　将100只8周龄的C57BL/6J雄性小鼠（体重20±3g）随机分为5组（每组20只）:正常对照组(NC)、糖尿病组(DM)、糖尿病+腺病毒空载体组(DM+Vector)、糖尿病+ADAM17基因干扰组(DM+ADAM17-shRNA)、糖尿病+ADAM17基因过表达组(DM+Ad-ADAM17)。4组糖尿病组小鼠连续5天腹腔注射55 mg/kg链脲佐菌素（Streptozotocin，STZ），正常对照组小鼠注射同体积的柠檬酸/柠檬酸钠缓冲液，作为溶媒剂对照。STZ注射完成1周后检测小鼠空腹血糖，血糖水平≥16.7mmol/L糖尿病小鼠造模成功。在糖尿病造模成功12、14和16周末，分别给予DM+Vector组、DM+ADAM17-shRNA组和DM+Ad-ADAM17组小鼠经尾静脉注射5×109 UT/200 uL空载体腺病毒、ADAM17-shRNA腺病毒和ADAM17-cDNA腺病毒。在糖尿病造模20周后末小鼠行安乐死，并留取血清、心脏、肾脏、肝脏、小肠等组织标本。<br>　　2.心功能的测量<br>　　使用异氟醚气体麻醉小鼠后，采用Vevo2100成像系统(VisualSonics，Toronto，Canada)使用超声心动图对小鼠的左心收缩和舒张功能进行无创性评估。<br>　　3.组织学和免疫组化染色<br>　　小鼠心脏在4％多聚甲醛中固定过夜。组织脱水包埋成蜡块，制作石蜡切片(切片厚度:4μm)进行后续实验。通过H&E染色观察心肌细胞大小、形态以及排列分布。通过Masson染色检测心肌间质纤维化情况。通过免疫组化检测心脏组织中ADAM17、ACE2的表达和分布。<br>　　4.小鼠心脏成纤维原代细胞（Cardiofibroblasts，CFs）的提取<br>　　选取新出生1～3天的小鼠乳鼠，经过严格消毒，取出心脏通过酶消化的方法分离提取CFs细胞，在37℃、5％的CO2孵育箱中使用含10％胎牛血清(FBS)的低糖DMEM培养基中培养。<br>　　5.细胞培养及分组<br>　　使用自己提取的CFs细胞，在37℃、5％的CO2细胞孵育箱中，使用含10％FBS的低糖DMEM培养基培养。当细胞融合度达到60％时加入高浓度葡萄糖刺激。为了研究ADAM17在高浓度葡萄糖作用下对成纤维细胞功能及信号通路的影响。我们将细胞分为6组进行干预:正常对照组(NC)、高渗组(HO)、高糖组(HG)、高糖+空载体组(HG+Vector)、高糖+ADAM17基因干扰组(HG+ADAM17-shRNA)、高糖+ADAM17基因过表达组(HG+Ad-ADAM17)。<br>　　6.实时定量RT-PCR<br>　　提取CFs细胞的总RNA，逆转录成cDNA后使用SYBR定量检测ADAM17和ACE2等表达。<br>　　7.ADAM17活性检测<br>　　使用SensoLyte520 TACE(α-Secretase)活性检测试剂盒检测，各组CFs细胞以及心脏组织蛋白裂解液中ADAM17活性。<br>　　8.酶联免疫吸附法(ELISA)<br>　　使用ELISA方法检测血清和细胞上清中ACE2的水平。<br>　　9.细胞免疫荧光染色<br>　　CFs细胞爬片处理后，使用细胞免疫荧光的方法检测S100A4和α-SMA的表达，观察成纤维细胞向肌成纤维转化的情况。<br>　　10.蛋白免疫印迹分析(Western blot)<br>　　提取CFs和小鼠心脏组织蛋白质裂解液，使用Westem blot的方法检测，胶原蛋白Ⅰ、胶原蛋白Ⅲ、TGF-β1、ADAM17、ACE2、AT1R、AT2R、MasR、α-SMA、p-p38、p38、p-Smad3、Smad3、GAPDH、β-tubulin、β-actin等蛋白表达。<br>　　结果：<br>　　1.糖尿病导致小鼠心肌间质纤维化和左心功能下降<br>　　2.ADAM17基因干扰可改善糖尿病性心肌病小鼠的心功能<br>　　3.ADAM17基因干扰改善糖尿病小鼠心肌间质纤维化以及心肌肥大<br>　　4.ADAM17可导致ACE2脱落而影响RAS系统<br>　　5.ADAM17干扰可抑制肌成纤维细胞转分化<br>　　6.肌成纤维细胞转分化信号通路研究<br>　　体内研究中发现，与对照组小鼠相比，糖尿病组小鼠心脏中TGF-β1蛋白及p-Smad3/Smad3的比例明显升高，而p-p38/p38并没有显著的统计学差异。<br>　　体外实验中发现，与对照组相比，33.3mM高糖刺激下CFs的p-Smad3/Smad3比例及TGF-β1的蛋白表达都升高，提示高糖导致TGF-β1/Smad3通路激活。<br>　　结论：<br>　　1.1型糖尿病导致的DCM小鼠心脏组织中ADAM17表达显著升高。<br>　　2.ADAM17基因干扰能显著改善DCM小鼠心肌间质纤维化和左心功能。<br>　　3.通过DCM体内和高糖CFs体外研究发现，ADAM17基因沉默通过减少ACE2的脱落进而调节RAS系统。<br>　　4.高葡萄糖刺激下，CFs向肌成纤维细胞转化增加，ADAM17基因沉默可降低CFs向肌成纤维细胞的转化。<br>　　5.DCM小鼠和高糖刺激下，ADAM17通过TGF-β1/Smad3通路影响CFs向肌成纤维细胞转分化。<br>　　论文Ⅱ 心肌特异性敲除ADAM17对糖尿病性心肌病的影响及机制研究<br>　　目的：<br>　　1.通过构建ADAM17心肌细胞特异性敲除小鼠，探讨敲除心肌细胞ADAM17对DCM小鼠左心功能、心肌间质纤维化、心肌细胞凋亡及自噬的影响。<br>　　2.通过转录本测序探讨DCM小鼠心肌中敲除ADAM17所产生的基因谱变化。<br>　　3.探讨敲除心肌ADAM17影响DCM小鼠心功能、心肌细胞凋亡和自噬的分子机制。<br>　　方法;<br>　　1.构建ADAM17心肌特异性敲除小鼠<br>　　2.2型糖尿病小鼠模型建立和分组干预<br>　　3.心脏功能评估<br>　　4.细胞培养<br>　　5.小干扰RNA(siRNA)转染<br>　　6.实时定量荧光PCR(qPCR)<br>　　7.蛋白免疫印迹分析(Western blot)<br>　　8.组织学染色<br>　　9.细胞免疫荧光染色<br>　　10.mRNA表达测序分析(RNA-seq)<br>　　11.GFP-RFP-LC3B检测自噬流<br>　　12.血脂检测<br>　　13.ADAM17活性检测<br>　　14.TUNEL检测<br>　　15.酶联免疫吸附试验(ELISA)<br>　　结果:<br>　　1.2型糖尿病DCM小鼠心脏中ADAM17的表达增加<br>　　2.心肌细胞中特异性敲除ADAM17改善DCM小鼠心功能<br>　　3.心肌细胞中特异性敲除ADAM17改善DCM心肌间质纤维化和心肌细胞凋亡<br>　　4.心肌细胞中ADAM17剪切细胞膜上的ACE2<br>　　通过ADAM17-siRNA处理发现，GP处理导致的ACE2脱落可被有效抑制，细胞ACE2蛋白水平明显升高。<br>　　5.小鼠心脏组织的基因表达谱分析,差异基因主要分布在氧化磷酸化，脂肪酸降解，心肌收缩，脂肪酸代谢和AMPK信号通路等方面。<br>　　6.DCM模型中，心肌细胞特异性敲除ADAM17激活AMPK信号通路<br>　　与正常对照组相比，糖尿病组小鼠心肌组织中AMPK活性下降。与ADAM17fl/fl糖尿病组相比，A17α-MHCKD糖尿病组小鼠心肌组织中AMPK显著活化。心肌细胞特异性敲除ADAM17激活AMPK信号通路。<br>　　7.高糖高脂诱导心肌细胞中自噬水平下降<br>　　8.高葡萄糖/棕榈酸盐刺激下，ADAM17基因干扰促进H9C2细胞TFEB核转位<br>　　9.DCM小鼠心肌自噬功能受损，而心肌敲除ADAM17可以改善自噬<br>　　10.高葡萄糖/棕榈酸盐刺激下，ADAM17基因干扰改善H9C2细胞自噬<br>　　结论:<br>　　1.心肌细胞敲除ADAM17可改善DCM小鼠左室收缩和舒张功能。<br>　　2.心肌细胞敲除ADAM17可改善DCM小鼠心肌间质纤维化和心肌细胞凋亡。<br>　　3.心肌细胞敲除ADAM17可导致DCM小鼠心肌组织中ACE2脱落减少。<br>　　4.心肌细胞敲除ADAM17通过心肌AMPK-TFEB-自噬途径调节DCM小鼠的左心功能、心肌间质纤维化及细胞凋亡。