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摘要背景：<br>　　结直肠癌(Colorectal cancer，CRC)是世界范围内最常见的癌症之一。在过去的几十年中，分子遗传学研究揭示了散发性和遗传性结直肠癌的发病机制主要是由于存在某些特定的遗传改变，包括一些肿瘤抑制因子的功能丧失，以及突变引起的癌基因的激活。有相关文献指出，某些序列发生特定的遗传基因的改变是CRC腺瘤到癌发展的基础。大多数情况下，认为是Wnt信号途径的激活导致了APC的失活突变，最终启动形成良性息肉。后来被认为是P53的失活突变以及转化生长因子β(Transforming growth factor-β，TGF-β)信号途径的激活引起的。有研究表明，男性在较早的年龄发展出结肠腺瘤和癌症，其发病率高于女性，然而，这种性别上的差异其分子机制在很大程度上仍然是不清楚的。近期有文章表明，结肠癌的发生发展可能与性别有关，提示可能跟性激素有关。雌激素抑制结肠癌的发生发展，而雄激素作用相反，能促进结肠腺瘤的发生发展。二氢睾酮(Dihydrotestosterone，DHT)由睾酮转化而来，它是体内雄激素的主要活性形式，有文献指出，在氧化偶氮甲烷(azoxymethane，AOM)诱导的结肠癌小鼠在体实验中，发现DHT能够促进腺瘤的发展，而且在肠黏膜固有层基质细胞（Stromal cells）可检测到少量DHT受体，也称为雄激素受体(Androgen receptor，AR)，然而目前还没有资料表明雄激素能够影响肠上皮的增殖分化及相关机制。<br>　　目的：<br>　　探究雄激素通过肠固有层基质细胞对肠上皮干细胞增殖分化的调节作用，揭示雄激素在肠道稳态维持中的作用及其机制。<br>　　方法：<br>　　1.细胞培养<br>　　1.1 Stromal cells培养<br>　　从小肠中提取的Stromal cells用含10％FBS、1％PS及l％Glutamax的RPMI1640培养基培养，Stromal cells加雄激素分别培养4h、8h、12h、24h，Stromal cells贴壁培养4-5天后即可传代。<br>　　1.2 Crypt和Stromal cells共培养<br>　　Crypt与stromal cells共培养，先提取crypt细胞，再将剩下的肠段消化3小时得到stromal cells，将两种细胞混合后与提前融化的基质胶混匀，种在预热好的48孔板上，分为Crypt组、Crypt+DHT组、Crypt+Stromal组、crypt+Stromal+DHT组，用含N2、B27、Glutamax、NAC、PS、EGF、Nogging、R-Sonding的DMEM F-12培养基分别培养4h、8h、24h、7day，每天拍照记录。<br>　　2.动物模型<br>　　2.1 雄鼠去势模型（ORX模型）<br>　　选取体重相近的6-8周雄性C57小鼠，将其随机分为Control组、ORX组、ORX+T组三组，麻醉小鼠后，ORX、ORX+T组行睾丸去势手术，Control组行假手术。ORX+T组腹腔注射DHT，0.53mg/kg/day，Control组小鼠、ORX组小鼠腹膜腔注射生理盐水，每日注射0.1mL/只，共注射21天。所有小鼠均在相同条件下饲养，不同组需分笼饲养。<br>　　2.2 雌鼠去势模型（OVX模型）<br>　　选取体重相近的6-8周雌性C57小鼠，将其随机分为Control组、OVX组、OVX+T组三组，麻醉小鼠后，OVX、OVX+T组行卵巢去势手术，Control组行假手术。OVX+T组腹腔注射DHT，0.53mg/kg/day，Control组小鼠、OVX组小鼠腹膜腔注射生理盐水，每日注射0.1mL/只，共注射21天。所有小鼠均在相同条件下饲养，不同组需分笼饲养。<br>　　2.3 AR抑制模型<br>　　选取体重相近的6-8周雄性C57小鼠，将其随机分为Control组、Flutamine组两组，麻醉小鼠后，Flutamine组腹腔注射10mg/kg的2-羟基氟他胺(2-hydroxy Flutamide)，Control组腹腔注射生理盐水，每日注射0.1mL/只，共注射14天。所有小鼠均在相同条件下饲养，不同组需分笼饲养。<br>　　2.4 BMP通路抑制模型<br>　　选取体重相近的6-8周雄性C57小鼠，将其随机分为Control组、ORX组、ORX+抑制剂组三组，麻醉小鼠后，ORX、ORX+抑制剂组行睾丸去势手术，Control组行假手术。ORX+抑制剂组腹腔注射3mg/kg的BMP抑制剂LDN193189，Control组小鼠、ORX组小鼠腹腔注射生理盐水，所有小鼠均在相同条件下饲养，不同组需分笼饲养。<br>　　3.蛋白提取<br>　　将建模完成的ORX小鼠安乐死，打开腹腔取小肠组织，加入裂解液后匀浆，充分匀浆后4℃离心机离心(12000rmp30min)，收集上清。上述提取的蛋白用试剂盒测得蛋白浓度，加入loading buffer后混匀，100℃金属浴煮7-8min。<br>　　4.蛋白免疫印记<br>　　根据蛋白定量结果，取一定量蛋白进行SDS-PAGE凝胶电泳、转膜、牛奶封闭、显影。<br>　　5.总RNA提取<br>　　5.1 组织<br>　　建模完成的小鼠安乐死后取小肠组织，加入RNAfixer后4℃过夜，次日去除RNAfixer后用RNA提取试剂盒提取RNA。测定RNA浓度后，以提取的RNA为模板逆转录得到cDNA-20℃保存。<br>　　5.2 细胞<br>　　Stromal cells加药培养4h，加胰酶消化，4℃离心得到沉淀;Crypt和Stromal共培养的细胞在不同时间段用细胞恢复液提取出来，离心收集细胞沉淀。细胞沉淀中加入裂解液，冰上裂解30分钟，用RNA提取试剂盒提取RNA。测定RNA浓度后，以提取的RNA为模板逆转录得到cDNA-20℃保存。<br>　　6.实时荧光定量pcr(qPCR)<br>　　以上述逆转录得到的cDNA为模板进行实时荧光定量PCR，分析各模型组织中Muc2、Mmp7、Chga的mRNA表达水平以及stromal细胞、crypt+stromal细胞中Wnt、BMP、Notch通路相关蛋白的mRNA表达水平。<br>　　7.染色分析<br>　　上述动物模型建模完成后，安乐死小鼠获得肠组织，用切片进行5-溴脱氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyUridine，Brdu）、Cha、Lysozyme染色分析以及Periodic Acid-Schiff(PAS)染色。<br>　　8.数据统计分析<br>　　得到每组数据，至少进行三次或三次以上独立重复实验，使用GraphPad软件对得到的数据进行统计学分析，P小于0.05表明具有显著性差异。<br>　　结果：<br>　　1.组化结果表明雄鼠去势后三种肠分泌系细胞的表达上调，添加雄激素DHT可以逆转这种现象;AR小鼠模型和雌鼠去势模型的结果也进一步证明雄激素有抑制肠分泌系细胞表达的作用。同时也检测到了分泌系细胞特殊标志物Mmp7、Muc、Chga的表达与组化结果相一致。<br>　　2.qPCR检测到雄鼠去势后Klf4、Elf3、Sox9、Ngn3、Atoh1、Hes1的表达上调，加雄激素后能够逆转这种现象，雄激素可能抑制了分泌系细胞分化相关决定因子的表达，最终导致了肠分泌系细胞的表达异常。<br>　　3.雄鼠去势以后Brdu+细胞数减少，activeβ-catenin蛋白的表达下调，同时检测到Bmp4和BmpⅠ型受体A(BmpRIA)的表达明显上调，加雄激素后会逆转这种现象。<br>　　4.肠上皮隐窝几乎没有发现AR阳性细胞，而有一定数量的AR在间充质中表达，4组隐窝的存活率并没有差异，雄激素对单独培养的隐窝没有影响，只有当与Stromal cells共培养时才能观察到隐窝细胞明显的增殖扩张。<br>　　5.单独培养的Stromal cells用DHT处理4h后对其进行检测，发现Wnt、Wnt5a、Wnt5b和Wnt2b的表达并没有明显的改变，但Wnt拈抗信号Dkk2、Dkk3和Sfrp1的表达明显降低，同时检测到Bmp4、Tgfb1信号的表达均有明显下调;还观察到DHT处理后共培养的细胞TGF-β信号通路的下游基因以及BMP靶基因的表达均有所减少。<br>　　6.BMP通路抑制模型中雄鼠去势之后Msx1和Id1的表达上调，且BMP信号途径抑制剂和雄激素在雄性去势小鼠肠干细胞的增殖和分化中有类似的作用，即去势之后三种肠分泌系细胞的表达增加，而BMP通路抑制剂LDN193189可以逆转这种现象。<br>　　结论：<br>　　肠黏膜Stromal cells表达AR，激活AR促进肠隐窝干细胞增殖而抑制分泌系细胞的分化，这种变化是通过影响BMP信号通路实现的。雄激素刺激AR参与BMP抑制剂的产生，导致BMP信号通路被抑制从而促进了肠干细胞增殖。我们的发现为男性结直肠癌较高发病率提供了合理的解释。