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摘要对于钛种植体的表面改性处理，传统策略的重点是进一步探索新的表面微形貌，改善成骨细胞在生物材料表面的物理附着等，然而除了优化细胞物理附着，粘附介质介导的信号通路应该被强调和调节，以有利于早期骨整合。SLA（sandblasted，large-grit，acid-etched;大颗粒喷砂-酸蚀）技术是最为经典，也是使用最为广泛的钛种植体表面改性的处理方式。成骨细胞通过整合素以间接方式粘附于种植体表面，整合素可以感受胞外表面微形貌的刺激，将其转导到细胞内，启动并调控胞内信号通路。YAP（Yes-associated protein，Yes相关蛋白）/TAZ（transcriptional coactivator with PDZ-binding motif，转录共激活因子与PDZ结合接口）可以从细胞质转移到细胞核，并通过转录共激活Runx2（runt-related transcription factor2，Runt相关转录因子2），调控成骨基因的表达。本课题组在前期研究工作中，已证明SLA钛表面微形貌影响成骨细胞中YAP/TAZ的胞内定位、表达，进而促进成骨细胞分化。而整合素可通过Ras相似物GTP酶(Rho GTPases)或通过调节细胞骨架张力，对YAP/TAZ发挥调控作用。<br>　　目的:<br>　　本实验在课题组前期研究基础上，制备SLA钛盘和光滑钛盘，观察两种钛盘表面MC3T3-E1细胞中α1、α2、β1整合素亚基的表达情况。并进一步在SLA钛盘上分别进行α1、α2、β1整合素亚基的基因沉默，检测YAP/TAZ以及Runx2等成骨标志基因的表达，结合前期实验结果，以明确SLA钛表面微形貌是否通过α1β1、α2β1整合素介导YAP/TAZ来进一步调控成骨细胞的分化。从而进一步解释SLA钛表面促骨结合的分子调控机制，为进一步改善种植体表面改性技术提供理论依据。<br>　　方法:<br>　　1.制备光滑钛盘和SLA钛盘，采用扫描电镜观察两种钛盘的表面微形貌，并采用光学轮廓仪测定其平均表面粗糙度Ra。<br>　　2.采用CCK-8（Cell Counting Kit-8，细胞计数试剂盒-8）技术检测两种钛盘表面MC3T3-E1细胞的增殖活性，采用ALP（Alkaline phosphatase，碱性磷酸酶）活性测定检测两种钛盘表面MC3T3-E1细胞的成骨分化能力。<br>　　3.采用qRT-PCR、Western blot技术检测SLA钛盘表面MC3T3-E1细胞中α1、α2、β1整合素亚基的表达情况。<br>　　4.在SLA钛盘表面培养MC3T3-E1细胞，采用siRNA转染技术分别沉默细胞中的α1、α2、β1整合素亚基，检测沉默效率;<br>　　5.采用qRT-PCR和Western blot技术检测沉默α1、α2、β1整合素亚基3天、7天、14天后，SLA钛盘表面MC3T3-E1细胞中YAP/TAZ的表达。<br>　　6.采用qRT-PCR和Western blot技术检测沉默α1、α2、β1整合素亚基3天、7天、14天后，SLA钛盘表面MC3T3-E1细胞中Runx2等成骨分化标志基因的表达情况;茜素红染色检测SLA钛盘表面，沉默α1、α2、β1整合素亚基14天时细胞的成骨分化水平。<br>　　结果:<br>　　1.光滑钛盘表面光滑，呈银白色金属光泽;而SLA钛盘表面粗糙，无明显金属光泽。扫描电镜下观察:光滑钛盘表面较平整，可见多道相互交错的划痕;SLA钛盘表面粗糙，未见喷砂颗粒残留，呈多级凹陷相互连续叠加状，扩大倍数观察发现，在直径约为10-40um的一级凹陷表面叠加直径2-4um的二级凹陷，部分二级凹陷中还可见直径不足1um的更小凹陷。SLA钛盘的平均表面粗糙度远高于光滑钛盘的平均表面粗糙度(P＜0.05)。<br>　　2.CCk8实验显示MC3T3-E1细胞在两种钛盘表面增殖活性良好，其中光滑钛盘的细胞数量略高于SLA钛盘。ALP半定量试剂盒测定结果显示:MC3T3-E1细胞在SLA钛盘表面的成骨分化活性明显高于光滑钛盘表面(P＜0.05)。<br>　　3.qRT-PCR和Western blot结果显示，SLA钛盘表面MC3T3-E1细胞中α1、α2、β1整合素亚基在mRNA和蛋白水平较光滑钛盘表面均呈现高表达(P＜0.05)。<br>　　4.采用siRNA转染技术分别沉默MC3T3-E1细胞中α1、α2、β1整合素亚基后，3种整合素亚基表达在mRNA、蛋白水平显著降低(P＜0.05)，沉默效率在70％左右。<br>　　5.SLA钛盘表面，MC3T3-E1细胞沉默α1、α2、β1整合素亚基后3天、7天、14天时YAP、TAZ的表达在mRNA、蛋白水平显著降低(P＜0.05)，且7天、14天时较3天时下降更为明显。<br>　　6.SLA钛盘表面，MC3T3-E1细胞沉默α1、α2、β1整合素亚基后3天、7天、14天后成骨标志基因Runx2、BSP（bone sialoprotein，骨涎蛋白）、OCN（osteocalcin，骨钙素）的表达在mRNA水平显著降低;其中Runx2的表达在7天和14天表达降低较3天时更为显著;BSP的mRNA表达水平在14天时下降最为明显;同样OCN的mRNA表达水平也在14天时下降最为明显(P＜0.05)。Western blot结果显示沉默3天时成骨指标Col1（typeⅠcollagenⅠ型胶原蛋白）、Runx2的表达水平下降;沉默7天时成骨指标Runx2、ALP、BSP的蛋白水平表达显著降低，其中ALP的降低最为明显;沉默14天时成骨指标Runx2、ALP、BSP、OCN的蛋白水平表达同样显著降低，其中OCN的降低最为明显，且BSP的降低较7天时更为显著;茜素红染色结果同样提示，沉默α1、α2、β1整合素亚基14天时细胞的成骨分化水平降低。<br>　　结论:<br>　　1.相较于光滑钛盘，SLA钛表面微形貌促成骨细胞分化。<br>　　2.SLA钛表面微形貌作用下，MC3T3-E1细胞α1β1、α2β1整合素表达升高。<br>　　3.SLA钛表面微形貌作用下，MC3T3-E1细胞通过α1β1、α2β1整合素感受胞外刺激，并介导了YAP/TAZ调控成骨基因的表达，进而促进细胞的成骨分化。