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摘要背景:<br>　　龋病和牙外伤是青少年的常见病和多发病，如果得不到及时而有效的治疗会导致牙髓坏死或根尖周病变，引起年轻恒牙牙齿发育停滞，相应地抗力减弱，严重影响患者的咀嚼功能和美观。根尖乳头干细胞(stem cells from apical papilla，SCAP)存在于发育中的恒牙根尖乳头组织，研究表明SCAP在牙根发育中发挥重要作用，因其与牙髓干细胞相比，有更强的增殖和分化潜能，成为牙髓牙本质再生重要的种子细胞。MicroRNA(miRNA)是一类非编码小分子RNA，可与目标mRNA的3’端非编码区（3'untranslated region，3'UTR）结合，从而负向调控靶基因的表达，发挥转录后调控的作用。研究发现，miRNA对间充质干细胞的成骨向分化有重要的调控作用，且多数通过信号通路进行调控。而有关miRNA对于根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化的调控机制尚不清楚。因此，本研究拟建立SCAP成骨/成牙本质分化相关的miRNAs表达谱，筛选并确定在SCAP成骨/成牙本质向分化中表达明显升高的miR-497-5p，探究miR-497-5p对SCAP成骨/成牙本质向分化的影响以及相关机制。阐明miR-497-5p调控SCAP成骨/成牙本质向分化的作用和机制，为牙髓牙本质再生研究提供实验依据，为优化miRNA参与的牙源性干细胞组织再生相关的治疗奠定基础，为年轻恒牙根尖周病变提供新的治疗策略和思路。<br>　　方法与结果:<br>　　第一部分 人根尖乳头干细胞的分离、培养和鉴定<br>　　方法:<br>　　采用酶消化法分离培养SCAP;利用CCK-8法检测SCAP连续10天的吸光度值并绘制生长曲线;结晶紫染色法检测细胞克隆形成能力;流式细胞仪检测SCAP表面分子标记;成骨和成脂诱导培养SCAP，通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色、油红O染色，进行多向分化能力检测。<br>　　结果:<br>　　原代培养7-10天，显微镜下可见有部分细胞呈团簇状贴壁生长，形态多为长梭形。CCK-8实验结果显示，SCAP的生长曲线整体呈“S”型，体现出明显的三个生长时期:潜伏期、对数生长期、平台期。结晶紫染色检测克隆形成率约为39％。流式细胞仪检测结果显示SCAP阳性表达间充质干细胞表面标记物STRO-1(31.8％)、CD24(23.2％)和CD146(99.5％)，造血分子表面标记物CD34(0.27％)和CD45(0.16％)则为阴性。成骨诱导7天，ALP染色显示胞浆呈明显的蓝紫色;成骨诱导21天，茜素红染色显示有大量的褐色矿化结节生成;成脂诱导28天，油红O染色显示胞质中有大小不一的红色脂滴形成。<br>　　第二部分 根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化前后差异性表达miRNAs的筛选和目标miRNA——miR-497-5p的确定<br>　　方法:<br>　　由北京博奥晶典公司采用Affymetrix的miRNA4.0表达谱芯片筛选出SCAP成骨诱导前后差异表达的miRNA;利用qPCR技术验证芯片结果，并挑选稳定差异表达的miRNA; qPCR检测miR-497-5p在SCAP成骨分化过程中的表达时相。<br>　　结果:<br>　　聚类分析结果显示，SCAP成骨诱导后共有64个miRNAs发生了改变(≥2.0倍)，其中25个miRNAs上调，39个miRNAs下调。选择2个上调(hsa-miR-660-5p，hsa-miR-497-5p)和3个下调(hsa-miR-181 a-2-3p，hsa-miR-3651，hsa-miR-6511a-3p)的miRNA进行qPCR验证，与芯片结果一致。其中，在SCAP成骨/成牙本质向分化中表达明显升高的是miR-497-5p，miR-497-5p在诱导第3天表达量有所降低，但无统计学意义，之后自第7天表达量明显上调，持续至21天。<br>　　第三部分 miR-497-5p对根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化的影响<br>　　方法:<br>　　利用细胞转染技术过表达/抑制表达miR-497-5p后，检测细胞ALP活性、成骨/成牙本质相关基因的mRNA及蛋白水平，并行ALP及茜素红染色。<br>　　结果:<br>　　过表达miR-497-Sp，ALP活性、成骨/成牙本质相关基因的mRNA及蛋白水平均升高，ALP染色显示更深染的蓝紫色，茜素红染色显示矿化结节明显增多。以上表明SCAP的成骨24h后更换为成骨诱导液培养7天/成牙本质向分化能力得到了促进;反之，抑制miR-497-5p的表达后，SCAP的骨向/成牙本质向分化能力被抑制。<br>　　第四部分 miR-497-5p在根尖乳头干细胞成骨/成牙本质向分化中的作用机制研究<br>　　方法:<br>　　利用生物信息学方法和双荧光素酶报告基因实验，确定miR-497-5p的直接靶基因为Smurf2;沉默Smurf2的表达后，检测细胞ALP活性、成骨/成牙本质相关基因的mRNA及蛋白水平，并行ALP及茜素红染色;分别过表达、抑制miR-497-5p表达以及沉默Smurf2的表达后，检测TGF-β/Smad通路相关蛋白表达情况;Western blot检测抑制内源性miR-497-5p并干扰Smurf2后成骨/成牙本质相关基因变化。<br>　　结果:<br>　　双荧光素酶报告基因实验显示，Smurf2是miR-497-5p的直接靶基因;沉默Smurf2后，SCAP的成骨/成牙本质向分化能力得到了促进;过表达miR-497-5p后TGF-β/Smad信号通路重要因子Smad2、Smad3、Smad4的表达量均有明显增加，而在抑制内源性miR-497-5p后，Smad2、Smad3、Smad4的表达量均有明显降低。在沉默Smurf2后，Smad2、Smad3、Smad4的mRNA和蛋白水平表达量均有明显增加;抑制内源性miR-497-5p，同时干扰Smurf2，结果发现干扰Smurf2后，miR-497-5p inhibitor抑制SCAP成骨/成牙本质向分化的作用都受到阻碍。<br>　　结论:<br>　　1.首次发现miR-497-5p具有促进SCAP成骨/成牙本质向分化的作用;<br>　　2.双荧光素酶报告基因实验证实Smurf2为miR-497-5p的直接靶基因;<br>　　3.发现Smurf2能够抑制SCAP的骨向/成牙本质向分化;<br>　　4.miR-497-5p通过Smurf2参与调控TGF-β/Smad通路，从而促进SCAP成骨/成牙本质向分化。