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摘要前列腺癌(PC)是最具侵袭性的恶性肿瘤之一，是人类恶性肿瘤死亡的第二大原因。众所周知，通过化学或手术去势的雄激素剥夺疗法最初可以很好的控制前列腺癌，但不可避免的，患者最终会进展为去势抗性前列腺癌(castration resistant prostate cancer，CRPC)，而对于CRPC，目前尚无有效的治疗方法。随着前列腺癌病情的进一步进展，会产生对化疗药物的耐药。因此，了解化疗的分子机制对于开发前列腺癌的有效治疗策略至关重要。<br>　　KLF4/GKLF是KLF样因子锌指蛋白亚家族的成员。目前，已经在许多人类癌症性疾病中观察到KLF4的表达失调，包括胃肠道，胰腺，膀胱和肺癌。据报道，KLF4的表达上调抑制细胞增殖，诱导细胞凋亡，并促进细胞周期停滞，这表明KLF4在多种恶性肿瘤中具有肿瘤抑制功能，并且其下调可能在肿瘤发生中起重要作用。然而，在鳞状细胞癌，乳腺癌和骨肉瘤中，KLF4显示出促进肿瘤细胞生长，促进细胞去分化和抑制细胞凋亡的作用。KLF4的致癌基因能力在很大程度上取决于组织、肿瘤类型或肿瘤细胞发展的阶段。在前列腺癌中，KLF4的表达水平显示为下调。KLF4的过表达抑制细胞生长和转移。尽管KLF4被证明是前列腺癌中的肿瘤抑制因子，但具体的分子机制仍然未知。<br>　　BIK(Bel-2interacting killer)是Bcl-2家族凋亡调节因子中BH3-only的促凋亡成员中的一员。Bcl-2分子家族中仅含BH3结构域的成员，包括：Bim，Bmf，Bik，Bad，Bid，Puma，Noxa和Hrk，它们介导许多细胞发育过程和诱导细胞毒性信号。BIK通过其BH3结构域直接调控Bcl-2和Bcl-XL，以使其抗细胞凋亡功能失活并以Bax依赖性方式引发细胞凋亡。BIK在发育，组织稳态，免疫和肿瘤抑制中起关键作用。BIK的活性通常受转录和/或多种转录后水平的调控限制，一些研究表明BIK的表达在死亡诱导刺激后增加。<br>　　微小RNA(miRNA)是一类长度大约为22nt的内源性非编码单链小RNA分子，普遍存在于真核生物中。它们可以通过切割特定靶mRNA或通过抑制其翻译来阻止蛋白质表达。在肿瘤细胞中，过表达miRNAs通过抑制抑癌基因促进肿瘤的生长，被称为致癌miRNA(oncogenic miRNAs，OncomiRs);而表达下调，通过抑制原癌基因表达来避免肿瘤的发展，被称为抑癌miRNA(tumor suppressor miRNAs)。miR-32-5p的失调与癌症的进展，发展，预后，转移，细胞凋亡和抗药性相关，但miR-32-5p在前列腺癌细胞中的确切作用和潜在分子机制尚不清楚。<br>　　在本项研究中，我们发现顺铂诱导前列腺癌细胞后KLF4表达增加，并且KLF4促进细胞凋亡。进一步的机制研究表明，KLF4直接与BIK的启动子区域结合，促进其转录。此外，我们还发现KLF4是miR-32-5p的直接靶基因。在顺铂处理后，miR-32-5p的下调促进KLF4的表达增加，并且增加前列腺癌对化疗的敏感性。因此，我们的研究数据显示KLF4是顺铂诱导前列腺癌细胞凋亡的必需调节剂，并且miR-32-5p-KLF4-BIK信号轴在前列腺癌化疗治疗中起重要作用。<br>　　目的：<br>　　1.阐明KLF4对BIK的正向调控关系;<br>　　2.阐明miR-32-5p对KLF4的负向调控关系;<br>　　3.阐明KLF4直接结合与BIK的启动子区域，并促进其转录;<br>　　4.阐明miR-32-5p靶向于KLF4-3'-UTR，抑制KLF4的表达;<br>　　5.明确miR-32-5p，KLF4和BIK在顺铂诱导下对前列腺癌细胞凋亡、增殖恶性表型的影响;<br>　　6.探讨miR-32-5p-KLF4-BIK信号轴调控前列腺癌细胞生物行为的分子机制。<br>　　方法：<br>　　应用CRISPR/Cas9技术敲除KLF4基因，RNAi技术下调KLF4和BIK的表达。构建慢病毒过表达载体pCDH-KLF4，pCDH-BIK。PCR抽提BIK上游0-1000bp基因组，双酶切插入到pGL3-based荧光素酶报告质粒，分别命名为P1(0-1000bp)，P2(1000-500bp)，P3(500-0)bp，检测KLF4下游BIK的转录活性。通过RNA测序分析，q-RT-PCR，Westernblot和染色质免疫沉淀(ChIP)研究KLF4在顺铂诱导前列腺癌中的分子机制。顺铂20μM处理PC3，DU145细胞系，Western blot检测KLF4，BIK蛋白的表达水平、对细胞凋亡的影响，及CCK8检测细胞增殖能力。瞬时转染miR-32-5p mimics及其NC、miR-32-5p inhibitors及其NC，q-RT-PCR和Westernblot检测miR-32-5p对内源性KLF4和BIK表达水平变化的影响。构建双荧光素酶野生型psiCHECK-2-KLF4-3'-UTR-WT及突变型psiCHECK-2-KLF4-3'-UTR-MUT重组表达载体，双荧光素酶报告实验检测miR-32-5p与KLF4-3'-UTR的靶向结合。顺铂20μM处理36h，q-RT-PCR，Western blot、CCK8检测miR-32-5p，KLF4对PC3，DU145细胞株凋亡及增殖能力的影响。<br>　　结果：<br>　　第一部分：KLF4增强顺铂处理前列腺癌细胞凋亡的实验研究<br>　　顺铂诱导前列腺癌PC3和DU145细胞株，发现KLF4的表达增加，并且KLF4的增加促进了前列腺癌细胞的凋亡。应用CRISPR/Cas9技术敲除了PC3和DU145细胞中的KLF4，并使用顺铂处理细胞。我们发现KLF4敲除明显减少了细胞凋亡，增殖增加。为了进一步证实，我们在PC3和DU145细胞中应用2个独立shRNA敲低KLF4表达。发现，抑制KLF4可显着降低细胞凋亡，增殖增加。相反，在过表达外源KLF4的前列腺癌PC3细胞株中，应用流式细胞仪检测细胞凋亡增加，增殖减少。<br>　　第二部分：KLF4通过调控BIK促进前列腺癌细胞株凋亡的分子机制研究<br>　　在KLF4敲除和敲低的PC3和DU145细胞株，应用顺铂诱导前列腺癌，发现BIK的表达下调。双荧光素酶报告基因实验证明KLF4直接与BIK的启动子区域结合，促进其转录。然后，我们在PC3和DU145细胞株中敲低BIK，用顺铂处理细胞。与正常对照细胞株相比，BIK的减少抑制了顺铂诱导的细胞凋亡，增殖增加。将BIK在KLF4敲除的PC3和DU145细胞株中过表达，发现BIK过表达逆转了KLF4缺失的前列腺癌细胞凋亡的减少，表明KLF4促进顺铂诱导的细胞凋亡依赖于BIK。<br>　　第三部分：MiR-32-5p调控KLF4在前列腺癌细胞株下降的分子机制研究<br>　　顺铂诱导PC3、DU145细胞株，PCR检测miR-32-5p的表达下调，促进了KLF4的表达。MiR-32-5p抑制前列腺癌中的KLF4表达，编码KLF4的基因是miR-32-5p的直接靶基因。在PC3、DU145细胞株中过表达miR-32-5p，然后用顺铂处理细胞，与对照组相比，miR-32-5p的表达上调减少细胞凋亡，增殖增加。相反，应用miR-32-5p的抑制剂增加了顺铂诱导的PC3、DU145细胞凋亡，增殖减少。随后，通过KLF4或BIK过表达可以恢复miR-32-5p过表达导致的细胞凋亡减少。MiR-32-5p通过KLF4-BIK信号轴调控前列腺癌对于顺铂化疗的敏感性。<br>　　结论：<br>　　KLF4是顺铂诱导前列腺癌细胞凋亡的必需调节因子。KLF4通过调节BIK表达，增强顺铂诱导的前列腺癌细胞凋亡。MiR-32-5p抑制前列腺癌中KLF4的表达，并通过在顺铂诱导下靶向KLF4，下调BIK的表达。MiR-32-5p-KLF4-BIK信号轴在增加前列腺癌对化疗敏感性中起重要作用。