检索历史 清除

摘要戊型肝炎病毒(hepatitis E virus，HEV)是全球范围内急性病毒性肝炎的最主要诱因之一，在一些发展中国家是50％的急性病毒性肝炎病例的诱发病原体，我国是戊型肝炎高发区之一。大部分的戊型肝炎患者，呈现典型的急性肝炎症状，病死率可达1％，孕妇患急性戊肝后症状更为严重，病死率可高达25％。HEV感染在免疫抑制人群中可能发展为慢性化并导致肝脏纤维化进展加快。此外，HEV感染还会导致多种肝外症状。<br>　　HEV感染的常用诊断指标有HEV IgM、HEV IgG及HEV RNA。HEV IgG用来指示HEV的既往感染和疫苗接种情况。HEV IgM是临床较为常用的诊断指标，主要用于指示HEV感染急性期，但是在恢复期也会有一段时间内呈现阳性。HEV RNA检测是检测病原体的有效方法，是诊断HEV现症感染的重要指标。但RNA检测成本较高，对检测仪器、操作人员以及检测场所均有一定要求，并且对样本的保藏与运输也有较高要求。HEV抗原作为病毒复制的另一重要指标，在HEV诊断上却没有得到较好的应用，主要原因是目前HEV抗原检测试剂灵敏度不足并且血液检测结果易受HEV抗体水平影响。本研究旨在建立灵敏度高、应用范围广的HEV抗原检测方法，并评估HEV抗原指标在临床中的应用价值。<br>　　首先，本研究基于96株HEV结构蛋白pORF2抗体，筛选获得最优抗体配对，构建了新的HEV抗原检测方法，检测灵敏度为6.3×103copies/mL。与原商品化试剂相比，改善了不同基因型抗原检测能力不一致的问题并且灵敏度提升了10倍以上。应用新的抗原检测方法，本研究发现血清中pORF2有两种存在形式:一种以经典的病毒粒子形式存在，与RNA结合构成病毒衣壳，命名为pORF2C;而另一种新发现的pORF2蛋白不与病毒RNA结合，命名为pORF2S。本研究的结果进一步揭示出两种形式pORF2的表达与orf2基因上的两个同框的AUG密码子有关，第一个AUG密码子位于1st nt，起始pORF2S的翻译;而第二个AUG密码子位于46th nt，起始pORF2C的翻译。HEV pORF2S占pORF2抗原的99.9％以上，pORF2S在血清中大量存在并且不与RNA结合的特点，决定了该指标是独立于HEV RNA的诊断新指标。HEV感染恒河猴系列标本的检测结果显示，HEV抗原阳性期与RNA阳性期基本重合，能够有效反映出病毒血症期以及排毒期。相较于原抗原检测试剂，新的抗原检测方法受血清抗体的干扰较小。由于新检测方法在灵敏度及检测周期上的明显优势，实现对原抗原检测试剂的升级替换。<br>　　基于急性肝炎队列标本，本研究对HEV IgM、HEV RNA与HEV抗原三个戊肝急性期指标进行了比较。研究显示HEV抗原在急性戊肝诊断中灵敏度为91.4％，特异性为99.8％，阳性预测值为96.0％。HEV IgM灵敏度略优于HEV抗原(92.3％)，但HEV IgM可在发病后持续32周，远长于已知3-4周的HEV感染急性期，这使得HEV IgM阳性预测值仅为64.8％。HEV抗原与HEV IgM联合检测能够有效的增加诊断的准确性，结合HEVRNA辅助诊断，能确诊95.7％的急性戊肝病例，实现经济、有效的急性戊肝诊断。对于厦门合格献血者HEV调查研究显示HEV抗原和HEV RNA的阳性率均为0.28％。对17名HEV RNA和HEV抗原均为阳性的献血者随访跟踪显示，10名献血者出现70天以上的HEV病原体阳性。与典型急性戊肝患者相比，这些HEV携带者体内的病毒水平较低，但是病毒血症、抗原血症时期较长，大部分HEV携带者未出现明显的抗体应答。这些HEV携带者的存在可能是输血安全的潜在威胁。<br>　　此外，为了拓展HEV抗原检测的应用范围，本研究建立了HEV抗原检测试纸条，在保持灵敏度不变的情况下，将检测时长缩短至15分钟。同时本研究还建立了基于抗原检测的HEV分类方法，实现不依赖测序的HEV快速分类。此外，本研究还发现HEV抗原在宿主肾脏高丰度聚集，HEV患者尿液中HEV抗原浓度为血液的47-5556倍，显示尿液可能是HEV诊断更好的采样标本。<br>　　综上所述，本研究通过重新筛选检测抗体配对，研发了新一代HEV抗原检测试剂，并发现其主要诊断靶标并非原本认识的病毒衣壳蛋白pORF2C，而是独立于病毒核酸的分泌型游离抗原pORF2S，该抗原及其产生机制的发现为HEV的诊断提供了新的靶标，也为理解抗原指标的临床意义提供了新的理论基础。在此基础上，本研究将该新靶标应用于急性肝炎诊断及献血者筛查中，优化了HEV的诊断流程并发现了HEV新的流行特点。这些研究成果为HEV的精确诊断及致病机制研究提供了有效的工具，此外本研究所发现的分泌型抗原pORF2S也为今后研究HEV的免疫逃逸、免疫耐受、生活史研究提供了重要的思路。