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摘要乙型肝炎病毒(hepatitis B virus，HBV)的慢性感染仍是危害人类健康的公共卫生问题之一，尽管预防性疫苗的普及显著减少了乙型肝炎病毒新发感染，但目前全球仍有超过2.57亿慢性HBV感染者需要及时有效的治疗。由于目前现有的治疗策略只能控制病毒的复制而难以完全治愈慢乙肝，因此开发更为有效的新型药物是迫切而必要的。新药的研发有赖于对HBV生物学和HBV与宿主相互作用的深入认识，这些研究的实施都需要能模拟HBV完整生命周期的体外细胞模型和体内动物模型的构建和发展。其中细胞模型是最常用且方便的用于体外研究HBV的感染和复制、HBV与宿主之间的相互作用、筛选和评价抗HBV药物的重要平台。本团队之前构建了两株细胞模型:HepG2-N10和HepG2-hNTCP(2B1)。其中HepG2-N10是在HepG2细胞中稳定整合了1.1倍体A基因型的HBV基因组，可以支持HBV复制和用于药物筛选和评价。另外HepG2-hNTCP(2B1)可以支持HBV感染和cccDNA形成，但是感染所需病毒剂量高且感染阳性率低，仅为20％～30％，同时感染时依赖PEG。本研究对MAPK抑制剂库进行筛选，旨在优化HepG2-hNTCP细胞感染模型，提高其感染效率和摆脱PEG的约束。同时寻找限制鼠肝细胞不能支持HBV感染的因子，进而构建支持HBV感染且免疫功能健全的小鼠模型。<br>　　本研究同时在复制模型HepG2-N10和感染模型HepG2-hNTCP上对140种MAPK抑制剂进行筛选，结果发现两种模型得到的结果差异显著。同时进行抗原水平相关性分析没有发现两种模型得到的结果有明显相关性。感染模型可以支持HBV感染，其病毒以类似自然感染状态进行复制，更符合HBV的生理。因此，可以说明复制模型用于药物筛选和评价的结果需要进一步验证。<br>　　本研究在2B1细胞模型中对140种MAPK抑制剂进行初步筛选，结果发现了30种MAPK抑制剂在感染后第六天加药处理能够增强HBV复制。进一步分析这30种MAPK抑制剂在感染前加入并持续添加对HBV感染的影响，结果显示有12种促进HBV感染效果显著。同时仅在感染前处理24小时，发现SCH772984，Trametinib，PD184352和Cobimetinib这四种MAPK抑制剂就能非常显著的提升HBV感染水平，其中HBeAg均提高了5倍以上，HBsAg均提高了10倍以上。<br>　　此外，本研究对这些MAPK抑制剂促进HBV感染的机制进行了初步探索。根据是否上调NTCP表达可将这些MAPK抑制剂分为NTCP途径依赖型和非NTCP依赖型。B-Raf IN1为NTCP途径依赖型的MAPK抑制剂，可以增强HBV的感染，特别是对cccDNA。对B-Raf IN1处理后的2B1细胞进行转录组测序，结果显示B-Raf IN1可增强NTCP的表达，另外与HBV感染和复制相关的宿主基因也有不同程度提高。目前已对上调的JunB基因进行了验证，发现过表达JunB可增强HBV在2B1细胞中的感染以及敲低后抑制HBV的感染，因此可以推出B-RafIN1促进HBV感染与增强JunB的表达有关。但是JunB本身是一种转录因子，并不能直接作用于HBV。因此仍需寻找与HBV感染更关键的因子。其他与HBV感染相关的宿主基因仍在验证当中。此外，针对非NTCP依赖型的MAPK抑制剂，首先猜想是否2B1细胞表面存在其他能与HBV结合的受体。因此，进行了HBsAg结合实验，结果显示B-Raf IN-1d，Pimasertib，SeIumetinib,PD0325901,SCH772984,Trametinib,TAK632和Cobimetinib能够明显增强HBsAg阳性率，说明这些MAPK抑制剂诱导了细胞表面某种能与HBsAg结合的蛋白，从而促进HBV的感染。进一步筛选了其中几个进行转录组测序，涉及HBV感染相关的宿主基因正在验证中。<br>　　综述所述，本研究在HepG2-hNTCP细胞模型中筛选出了几种能显著促进HBV感染了MAPK抑制剂并对其作用机制进行了初步探索。为构建更优的体外细胞感染模型提供了可能。