检索历史 清除

摘要甲型流感病毒(InfluenzaAvirus，IAV)是人类最重要的病原体之一，解析其生命周期为发现新的抗病毒策略至关重要。脱壳是IAV生命周期必不可少的步骤，是抗病毒治疗的潜在靶点。但是，实时示踪解析IAV病毒进入细胞后的脱壳过程，一直是未能实现的科学难题。单病毒示踪有望实时、动态、高时-空间分辨地解析流感病毒脱壳的这一瞬时动态过程与机制。IAV的基因组是特殊的八个RNA片段组成模式。目前，对于IAV基因组缺乏有效的荧光标记方法，加上病毒脱壳研究方法的不足，对流感病毒脱壳的动力学过程知之甚少。本论文针对流感病毒脱壳这一极具挑战的科学难题，利用具有高荧光强度的无机纳米材料量子点(Quantum dot，QD)标记流感病毒遗传单元vRNP，开发了一种新的病毒基因组标记方法，获得QD标记vRNP病毒（IAV-QD），结合单颗粒示踪技术揭示了流感病毒脱壳的动态过程与机制，具体研究结果如下:<br>　　第一，QD标记vRNP病毒(IAV-QD)的制备和表征。利用IAV反向遗传学八质粒系统，改造其中的pHW2000-PA质粒，插入生物素受体肽序列(AP tag)构建pHW2000-PA-AP tag重组质粒，获得了能够稳定复制的重组流感病毒rPR8-PA-AP。在病毒感染过程中，结合在vRNP顶端的RNA聚合酶蛋白PA被可控地生物素化，并与链霉亲和素修饰的量子点(SA-QDs)特异性结合，QD标记的vRNP组装入成熟的子代病毒中，从而获得含有基因组被量子点标记的流感病毒。对纯化后IAV-QD的荧光特性、免疫印迹/荧光分析、病毒形态、包装量子点数目、病毒毒力以及病毒入侵动力学进行了一系列的表征和分析，证实了此标记方法获得的量子点标记病毒与已知报道的多种荧光蛋白标记病毒具有相似的复制能力，且病毒的入侵动力学与野生型病毒基本一致，能够用于单病毒示踪研究。<br>　　第二，单颗粒实时示踪IAV-QD入侵细胞过程。量子点高亮度、耐光漂白等优异的光学性质使得IAV-QD可用于活细胞内的单病毒示踪，与之相比，在PA蛋白上融合表达EGFP荧光蛋白的重组病毒rPR8-PA-EGFP，其低EGFP丰度导致单颗病毒的荧光强度不足以用于单病毒追踪。活细胞实时示踪表明IAV-QD的荧光信号可被长时间追踪，揭示了病毒粒子三阶段胞内运输过程和vRNP入核和核内运输过程。IAV-QD活细胞入侵实验证实了此标记方法可用于病毒的活细胞示踪，为病毒脱壳可视化研究奠定了基础。<br>　　第三，实时动态示踪揭示流感病毒脱壳重要机制。<br>　　(1)通过IAV-QD病毒粒子侵染MDCK细胞，同时结合早晚期内体标志物的荧光标记对病毒的脱壳过程进行实时示踪，观察到IAV经内体途径在细胞质中转运，IAV由早期内体运输到晚期内体，期间发生内体间的募集、融合及内体的成熟，最终vRNP从晚期内体释放逃逸至细胞质的动态过程。<br>　　(2)结合病毒包膜量子点标记技术获得内外双色量子点标记病毒，实时示踪vRNP从包膜中释放的病毒脱壳动态过程。利用内外双色量子点标记病毒感染荧光标记晚期内体的宿主细胞，实时示踪内外双色量子点标记在晚期内体中发生病毒脱壳，vRNP从晚期内体中释放，包膜滞留在晚期内体中的动态过程。约31.1％的病毒在感染后30-90min内发生脱壳。<br>　　(3)实时示踪两种量子点标记不同vRNP的IAV病毒(IAV-QD(625+705))，观察到单颗病毒的两种vRNP在核周区发生分离。将IAV-QD(625+705)进行包膜量子点标记，实时示踪病毒发生脱壳时，共定位的QD625-vRNP和QD705-vRNP分离成vRNP单体从QD525-包膜中释放的动态过程。标记晚期内体后可以观察到相同的现象即共定位的QD625-vRNP和QD705-vRNP分离成vRNP单体从晚期内体逃逸至细胞质中。<br>　　(4)抑制M2质子通道活性或抑制内体酸化均能显著抑制病毒脱壳。<br>　　(5)完成脱壳后的vRNP单体以三阶段主动运输机制完成入核，入核的vRNP以两种不同的扩散模式在细胞核内运输。<br>　　综上所述，本研究首先建立了量子点特异性标记IAV遗传单元vRNP并包装进入活病毒的技术。实时解析了流感病毒脱壳的动态过程:在感染后30-90min内，30％的病毒粒子与细胞内的晚期内体发生融合完成病毒脱壳，将病毒核心vRNP释放至宿主细胞核周区域，病毒粒子内八个vRNP在脱壳过程中以单独而非组团的方式从晚期内体中释放进入细胞质，这些单独的vRNP在核周区以三阶段的主动入核机制进入细胞核，vRNP在细胞核内以两种不同的扩散模式运输。本论文揭示了IAV脱壳和vRNP运输机制，填补了对这部分IAV感染认识的缺失，同时也为发展抵御流感病毒感染策略提供了新的思路。