检索历史 清除

摘要茶黄素（Theaflavins，简称TFs）是一类含有卓酚酮结构的化合物，其是通过氧化一个含有二羟基的B环和另一个含有三羟基的B环的儿茶素形成。TFs除了对红茶的颜色和滋味有重要作用外，还拥有许多生物活性，但其在红茶中的含量较低，直接从红茶中分离提取是不经济的，利用多酚氧化酶(PPO)和过氧化物酶(POD)的氧化特性来有目的地生成TFs被视为行之有效的方法。在反应中，PPO主要生成TFs和相对简单的二聚体，而POD不仅能生成TFs，还能将TFs进一步氧化为结构更为复杂的多聚体茶红素，所以本论文以PPO为主要研究对象。目前，PPO主要从植物或真菌中分离纯化得到，但分离纯化的过程比较繁复。因此如何获得大量且有活性的PPO成为TFs研究和应用的关键，通过基因工程技术在体外表达PPO对于制备TFs有重要的理论和实际意义。本论文从已知的近百条PPO基因中选取部分PPO基因进行异源表达，首选已经进行过异源表达的，其次为近年来研究比较热门的PPO基因。此外，由于游离酶不能重复使用且在极端pH、高温和储藏条件下易于失去活性，阻碍了其在工业中的应用。利用酶固定技术能有效的克服游离酶的这些缺陷，为扩大规模和商业化生产TFs提供一定的理论基础。<br>　　论文第一章主要介绍了选题背景及意义、本论文提出及拟解决的关键问题。<br>　　论文第二章主要阐述了植物与真菌PPO的异源表达及其合成TFs的酶活力研究。首先，比较了不同植物组织PPO粗酶合成TFs的活性。其次，根据文献报道，对10个物种中的17条PPO基因进行克隆，然后将测序正确的基因构建到表达载体pET32a(+)上并转入BL21(DE3)中进行异源表达，其表达的蛋白分子量符合预期大小且大部分PPO的表达量高、可溶性好。以茶多酚为底物比较重组PPO合成TFs的酶活力，结果表明8个PPO有催化合成TFs的活性且活性大小为:Pp4（梨）＞Md2（苹果）＞Ej2（枇杷）＞Jr2（核桃）＞Jr1＞Vv-1（葡萄）＞Cg1（金鸡菊）＞Vv-5。这是首次成功利用PPO重组酶催化合成TFs。<br>　　论文第三章主要讲述了PPO重组酶生物转化制备TFs的研究。首先，对重组PPO进行酶固定，既采用了有载体的固定（介孔二氧化硅和碳纳米管），也采用了无载体的CLEAs技术，在固定方法上也优选了几种可行性较高的，结果显示以介孔二氧化硅为载体的固定酶活性最高，依次为碳纳米管、CLEAs技术。将粗酶活性较高的Ej2、Md2和Pp4分别固定到介孔二氧化硅上，结果显示固定后的Md2活性最高。遂将Md2纯化后再进行固定，发现纯酶固定后的活性明显提高，几乎是游离酶的两倍。此外，游离酶在pH5和10-30℃条件下有最大活性，而固定酶则显示出更宽的最大活性范围（pH4-6和10-40℃）。在pH稳定性和热稳定性方面，固定酶的活性基本保持不变，而游离酶的活性升高了，但仍低于固定酶的活性。固定酶经过8次重复使用和4℃储藏25d后分别有近40％和70％的初始酶活性得以保留。其次，考察了重组PPO全细胞催化合成TFs的活性情况，包括底物饲喂、静息，但结果表明无TFs生成。<br>　　论文第四章主要对植物与真菌PPO的研究进行了综述。首先，介绍了PPO的种类和当前最新的催化机理。其次，对植物和真菌天然PPO的研究进行了归纳和总结，包括分离纯化新物种PPO、底物特异性和抑制剂的探究等。同样，对植物和真菌PPO酶基因的研究也进行了概括和汇总，包括基因克隆以及异源表达等。最后，介绍了PPO生物转化在各个领域中的应用。