检索历史 清除

摘要溶酶体是重要的膜性细胞器，其动态变化与稳态维持关系到细胞的存活、分化与死亡。溶酶体在生命活动中发挥着重要作用，并与多种疾病的发生发展密切相关。在细胞凋亡过程中，BCL2家族的促凋亡蛋白介导溶酶体膜和线粒体膜的通透，促进凋亡诱导因子的释放，进而导致细胞内膜系统的崩解;在细胞自噬过程中，溶酶体膜表面的蛋白复合物可以感知细胞的营养和能量状况，通过MiT/TFE家族的转录因子协同调控溶酶体内部和膜表面相关蛋白的表达，促进溶酶体与自噬小体的膜融合，降解膜内包裹的物质，参与细胞自噬的执行和调控。在这些重要的细胞生命活动中，溶酶体的动态变化常伴随着内膜系统的崩解、重构和融合，并由特定的蛋白所介导。<br>　　本文以溶酶体膜动态变化的调控机制为中心科学问题，第一部分内容以细胞凋亡的溶酶体—线粒体途径为基础，对BCL2家族的促凋亡蛋白tBid在溶酶体膜上发生寡聚、形成通道、诱导膜通透并启动细胞凋亡的分子机制进行了研究。首先通过脂质体荧光染料泄漏的方法，证实tBid可以在不借助其他蛋白的情况下与磷脂膜（模拟溶酶体膜组分）结合并诱导膜通透，形成允许较大分子(分子量可至250kDa)透过的通道;为了进一步研究tBid诱导膜通透的分子机制，应用中国科学院物理研究所李明课题组利用氧化型石墨烯的荧光淬灭效应研发的单分子表面诱导荧光衰逝技术，在tBid蛋白的特定氨基酸位点标记荧光分子并结合单颗粒追踪，实现了对tBid蛋白在磷脂膜上三维运动的动态分析。通过对大量单分子实验数据的统计分析，发现当tBid蛋白单体与磷脂膜结合时，其6个α螺旋整体处在膜表面的位置，其中α6和α7螺旋嵌入膜的深度较浅;随着与磷脂膜作用时间的延长，部分tBid蛋白分子的α6和α7螺旋更深地嵌入磷脂膜内，并在膜上形成不同聚集程度的稳定寡聚体，在寡聚体内部分蛋白分子嵌入膜内较深的位置(α3螺旋嵌入膜内的深度可至1.5nm，α6和α7螺旋为2.0nm)。据此提出tBid诱导膜通透的环形通道模型。此外，还对BAX或BCL2L1与tBid相互作用的二元体系进行了研究，并确认在BAX的作用下，tBid的α3和α6螺旋可嵌入到磷脂膜内更深的位置;而在BCL2L1存在时，原本嵌入膜内的螺旋伸展出膜外，其原因可能是tBid的BH3结构域与BAX或BCL2L1发生相互作用，导致tBid在膜上的构象发生改变。<br>　　本文第二部分重点研究了磷酸化修饰调控转录因子TFEB转位入核的结构生物学机制。通过免疫共沉淀和等温滴定微量热的方法，确定TFEB的S211是影响与YWHA发生相互作用的关键磷酸化位点，并定量确定了TFEB pS(211)磷酸肽与YWHA两个亚型的亲和力参数。在获得了TFEB pS(211)磷酸肽与YWHA蛋白的复合物晶体后，与中国科学院生物物理研究所冯巍课题组合作，通过X射线衍射的方法解析了蛋白复合物的三维结构，确定TFEB pS(211)磷酸肽通过疏水作用力、静电作用和氢键与YWHA蛋白结合，并发现TFEB S211附近与YWHA结合界面的部分氨基酸也影响TFEB与YWHA的相互作用。TFEB结合界面的S209A、P213A、A214Q或L216Q突变会减弱其与YWHA的相互作用，而T208R突变则增强其与YWHA的相互作用。细胞实验进一步表明TFEB与YWHA结合界面的氨基酸显著影响TFEB的亚细胞分布以及转录活性，并影响溶酶体的生成和细胞自噬水平。S209A、S211A或L216Q突变使TFEB倾向于分布在细胞核，增强其转录因子活性，上调溶酶体相关基因的表达水平，从而促进溶酶体的生成，增强细胞自噬;而T208R突变则在一定程度上抑制TFEB转位入细胞核，其促进溶酶体相关基因的表达、溶酶体的生成等细胞生物学效应弱于野生型TFEB。<br>　　综上所述，本文以Bid和TFEB这两个分别参与细胞凋亡和细胞自噬途径的重要蛋白为研究对象，通过结构生物学的技术方法初步阐明了其影响溶酶体稳态的调控机制，并为以BCL2家族或MiT/TFE家族蛋白为靶标的药物开发提供了基础数据。