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摘要无细胞非天然蛋白质合成系统作为细胞内非天然蛋白质合成的有力的补充手段，可扩展蛋白质的结构及功能，并且已成功应用于蛋白质相关的基础科学研究及工业生产领域。无细胞非天然蛋白质合成系统不需完整的活细胞，而是依靠细胞提取物，添加能量底物及各种辅因子，因此打破了细胞膜的屏障作用，增强了对体系进行工程设计和过程精细调控的灵活性;此外，可通过引入一些功能性非天然氨基酸，改善蛋白质的某些特性，甚至赋予蛋白质新的结构及功能特性，如模拟真核生物的蛋白翻译后修饰、引入正交反应手柄及生物物理探针，合成多聚蛋白质材料等。目前无细胞非天然蛋白质合成系统中非天然氨基酸的嵌入方法可分为两大类，一类为基于天然翻译体系的全局抑制，一类为基于正交翻译体系的终止密码子抑制、移码抑制、有义密码子再分配及非天然碱基对的方法。目前应用最广泛的是终止密码了抑制方法中的琥珀抑制法。<br>　　本文首先系统地综述了无细胞蛋白质合成系统中的非天然氨基酸嵌入方法及非天然蛋白质应用的主要研究进展，并分析了该体系发展面临的机遇和挑战，包括嵌入效率低及不易扩大等问题;其次，建立了无细胞非天然蛋白质合成平台，并从报告蛋白选择、底盘细胞种类及培养基选择、反应的最适条件、质粒模板浓度、高活性正交氨酰tRNA合成酶制备及正交翻泽组分的最适添加浓度方面对体系进行了优化，旨在最小毒性作用下实现高非天然氨基酸嵌入效率和高非天然蛋白质表达水平，具体如下:<br>　　1)绿色荧光蛋白为最佳的报告蛋白，反应的最适条件为30℃，16h;<br>　　2)通用的细胞中E coli Rosetta(DE3)最佳，可达到60％的非天然氨基酸嵌入效率;<br>　　3)质粒模板添加量应在600～800ng，四种正交翻译组分的使用最适浓度为:75ng/μL的o-tDNA，0.04mg/mL的pPaFRS和5mM的pPaF，0.5mg/mL的pAzFRS和2.5mM的pAzF，0.5mg/mL的pAcFRS和2.5mM的pAcF，0.3mg/mL的pBpFRS和10mM的pBpF。<br>　　然后，探究了影响非天然氨基酸嵌入效率的因素，包括底盘细胞的基因组改造的影响，如TAG至TAA的突变和编码释放因子1的prf基因的敲除;肽链上非天然氨基酸嵌入位点与N/C端的距离与正交翻译体系嵌入非天然氨基酸的关系;嵌入位点附近的碱基或密码子种类对非天然蛋白质表达的影响，包括第四碱基效应和稀有密码子效应，旨在为非天然氨基酸的高效嵌入提供可供参考的准则，具体如下:<br>　　1)通过改造底盘细胞解除o-tRNA与RF1的竞争（如E.coli C321.AA），可实现100％的非天然氨基酸嵌入效率，及1.0mg/mL的单位点非天然氨基酸嵌入的非天然绿色荧光蛋白表达;<br>　　2)肽链上非天然氨基酸嵌入位点与N/C端距离与非天然氨基酸嵌入效率无相关关系;<br>　　3)第四碱基为嘌呤核苷酸(A，G)比嘧啶核苷酸(T，C)更利非天然氨基酸嵌入;<br>　　4)嵌入位点前存在1或2个稀有密码子时，可抑制非天然氨基酸的嵌入，2个稀有密码子存在时效应更显著;<br>　　最后，探索了无细胞非天然蛋白质合成系统中的多个非天然氨基酸的嵌入，并尝试通过抑制剂的添加提高非天然蛋白质的表达量，最终实现了0.2mg/mL的含4个非天然氨基酸的绿色荧光蛋白。