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摘要本文主要从以下几个部分展开论述：<br>　　第一部分 Vasohibin-2在上皮性卵巢癌中的表达与临床意义<br>　　目的:检测Vasohibin-2(VASH2)在上皮性卵巢癌(Epithelial Ovarian Cancer,EOC)中的表达水平，并评估其表达在EOC中的临床意义。<br>　　方法:用实时荧光定量PCR(quantitative real-time PCR，qRT-PCR)和免疫组织化学法（Immunohistochemistry,IHC）在EOC组织、癌旁组织、正常卵巢组织中检测VASH2的表达，并结合临床随访资料，用Kaplan-meier生存曲线和Cox回归分析评估EOC患者的预后。<br>　　结果:qRT-PCR的方法检测新鲜卵巢癌组织、癌旁组织和正常卵巢组织中VASH2mRNA的相对表达，结果显示:卵巢癌Ⅲ-Ⅳ期，卵巢癌Ⅰ-Ⅱ期，癌旁组织和正常卵巢组织中VASH2mRNA水平分别为8.961±0.723;3.136±0.452;1.258±0.214;1.362±0.537。提示VASH2mRNA在Ⅲ-Ⅳ期EOC组织中表达显著高于Ⅰ-Ⅱ期EOC组织(P=0.012)，各期EOC卵巢癌组织中VASH2mRNA平均表达显著高于在癌旁组织和正常卵巢组织中的表达(P=0.004)。免疫组织化学染色结果显示83例上皮性卵巢癌组织VASH2蛋白表达阳性率为95.18％(79/83)，而癌旁组织和正常卵巢组织表达阳性率分别为2.41％(2/83)和0％(0/78)，提示上皮性卵巢癌组织中VASH2蛋白表达显著高于癌旁组织和正常卵巢组织（P=0.001）;另外，通过对临床相关数据分析结果显示VASH2蛋白在上皮性卵巢癌中的表达与患者FIGO分期、病理分级、血清CA125以及血清HE4存在相关性，而与年龄、组织学类型、腹水是否找到癌细胞无关。Cox回归分析显示VASH2高表达(P=0.002)、FIGO分期晚(P=0.001)为上皮性卵巢癌预后差的独立因素。Kaplan-Meier生存曲线显示EOC患者VASH2高表达组比低/不表达组的五年生存率明显降低。<br>　　结论:<br>　　(1)检测VASH2的表达可以作为评估上皮性卵巢癌患者预后的生物学标志物。<br>　　(2)VASH2高表达预示上皮性卵巢癌患者的预后不良。<br>　　第二部分 Vasohibin-2基因表达对上皮性卵巢癌细胞生物学行为和上皮-间质转化的影响及其对化疗耐药的作用机制研究<br>　　目的:<br>　　研究Vasohibin-2(VASH2)在卵巢癌细胞株中的表达情况，探讨干扰及过表达VASH2对卵巢癌细胞株生物学行为和上皮-间质转化的影响及其对化疗耐药的作用，为阐明卵巢癌的发病机制，寻求有效的针对卵巢癌治疗策略提供理论和实验依据。<br>　　方法:<br>　　1.通过qRT-PCR和免疫印记(Western Blot)方法检测卵巢癌细胞株HO-8910A2780和SK-OV3中VASH2mRNA和蛋白的表达，选择VASH2高表达的HO-8910细胞株，构建shRNA载体，对HO-8910细胞株采用qRT-PCR和免疫印迹检测转染shRNA-1、shRNA-2、shRNA-3、shRNA-4及shRNA-NC后，观察细胞中VASH2蛋白表达的变化。转染后shRNA-3组VASH2蛋白表达最少，干扰效果最好，选取shRNA-3进行后续实验。<br>　　2.将HO-8910细胞株分为正常组，shRNA组，空载体组，顺铂组，shRNA+顺铂组五组予以处理，通过MTT、Transwell实验和细胞划痕实验来探讨shRNA-3转染后对肿瘤细胞增殖、存活及侵袭和转移能力的影响以及与顺铂联合作用后对卵巢癌细胞生物学行为的影响，通过免疫印迹检测其对凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白和上皮-间质转化(epithelial-mesenchymal transition，EMT)相关蛋白的影响;<br>　　3.选择VASH2低表达的A2780细胞株，构建VASH2过表达载体，将A2780细胞株分为正常组、空载体组、VASH2过表达组、顺铂组及VASH2过表达+顺铂组进行处理，通过MTT试验、Transwell实验和细胞划痕实验来检测VASH2过表达后对肿瘤细胞增殖、存活及侵袭和转移能力的影响以及与顺铂联合作用后对卵巢癌细胞生物学行为的影响，免疫印迹检测其对凋亡相关蛋白、自噬相关蛋白和EMT相关蛋白的影响。<br>　　结果:<br>　　1.qRT-PCR和免疫印迹检测各组卵巢癌细胞株中VASH2 mRNA及蛋白的表达，发现VASH2在HO-8910细胞株中高表达，在A2780细胞株中低表达，差异有统计学意义(P=0.0002，0.0005)。<br>　　2.将构建的5种shRNA载体转染VASH2高表达细胞株HO-8910后，检测对VASH2表达的影响，发现转染shRNA-3抑制VASH2的表达最佳(P＜0.05)。<br>　　3.VASH2高表达细胞株HO-8910转染shRNA-3，MTT细胞增殖试验中比较正常组、shRNA组、空载体组、顺铂组及shRNA+顺铂组的结果发现:shRNA组，顺铂组及shRNA+顺铂组肿瘤细胞的增殖能力明显下降。而且shRNA联合顺铂给药后抑制肿瘤细胞增殖更明显，且存在时间依赖性，差异有统计学意义（P＜0.05）。Transwell细胞侵袭实验过程中比较正常组，shRNA组，空载体组，顺铂组及shRNA+顺铂组细胞的侵袭能力，结果发现:shRNA组，顺铂组及shRNA+顺铂组细胞的侵袭能力显著下降，而且shRNA+顺铂组的细胞数明显低于其余各组（P＜0.05）。细胞划痕试验中，shRNA+顺铂组细胞的划痕愈合速度较慢，表明shRNA-3干扰VASH2表达能有效的抑制卵巢癌细胞的迁移能力(P＜0.05)。免疫印迹检测结果提示:HO-8910细胞转染shRNA-3干扰VASH2表达后， p53、Caspase-3和PARP的表达上调，AKt、LC3B和Vimentin蛋白表达下降(P＜0.05)。转染shRNA-3的HO-8910细胞中加入顺铂联合作用后，和DDP组相比p53、Caspase-3和PARP的表达进一步上调，AKt、LC3B和Vimentin蛋白表达进一步下降(P＜0.05)。<br>　　4.A2780细胞株转染VASH2过表达载体后，MTT细胞增殖试验提示，与正常组和空载体组相比，VASH2过表达后细胞的增殖活性增加（P＜0.05），VASH2过表达联合顺铂给药组的A2780细胞活力介于VASH2过表达组和顺铂组之间，与正常组相比，细胞活力还是明显下降，但与顺铂组相比，细胞活力明显上升，并具有一定的时间效应，48h以后效果明显，(P＜0.05)。Transwell细胞体外侵袭实验提示，A2780细胞转染过表达VASH2后细胞的侵袭能力增加，顺铂组则抑制了细胞的侵袭能力，VASH2过表达联合顺铂给药组侵袭能力介于两者之间，与正常细胞组比较，细胞侵袭能力下降，但与顺铂组相比，细胞侵袭能力增强(P＜0.05)。细胞划痕试验中，A2780细胞转染过表达VASH2后细胞的迁移能力明显增加，VASH2过表达细胞联合顺铂组迁移能力介于两者之间，与正常组和空载体组相比，细胞迁移能力下降，但与顺铂组相比，细胞的迁移能力增强（P＜0.05）。免疫印迹检测结果显示:VASH2过表达后p53、 Caspase-3和PARP表达下降，AKt、LC3B和Vimentin表达升高。顺铂组p53、 Caspase-3和LC3B表达上升，AKt、PARP和Vimentin表达下降;和DDP组比较而言，OE+DDP组中p53、 Caspase-3和PARP表达下降，AKt、LC3B和Vimentin表达上升（P＜0.05）。<br>　　结论:<br>　　(1)干扰VASH2表达能有效的抑制EOC细胞的增殖、侵袭和迁移。<br>　　(2)干扰VASH2表达可降低EOC细胞恶性生物学能力，增加EOC细胞凋亡，调节自噬作用，降低EMT并加强顺铂的作用。<br>　　(3)VASH2过表达会增强EOC细胞的恶性生物学能力，降低EOC细胞凋亡，加强细胞自噬和EMT，并使顺铂作用下降，增加化疗耐药。<br>　　(4)VASH2基因在上皮性卵巢癌中是一个具有良好预后评价和靶向治疗价值的癌基因。