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摘要糖尿病肾病(Diabetic kidney disease，DKD)通常是指糖尿病引起的肾脏损伤。DKD属于中医的“消渴”、“肾消”等范畴，是目前引起终末期肾病(End-Stage Renal Disease，ESRD)的重要因素。足细胞损伤被认为是DKD发病和发展的中心环节，探讨足细胞的病理损伤和功能改变并抑制这种进展一直是DKD治疗的关注热点。<br>　　蛹虫草（Cordyceps militaris，CM）可益肾补阳，对DKD具有良好的改善作用。蛹虫草多糖(Cordyceps militaris polysaccharides，CMP)是蛹虫草的重要活性物质，研究发现CMP可减轻DKD肾功能损伤，改善DKD，其确切调节机制有待进一步研究。<br>　　自噬是普遍存在于真核细胞中的一种依赖溶酶体的胞内降解系统，能清除细胞中损伤或衰老细胞器及生物大分子，维持细胞自身稳态。研究表明，自噬与肾小球足细胞损伤密切相关，广泛参与各类肾脏疾病发生、发展，可能作为治疗肾脏疾病的一个新途径。此外，研究显示，Janus激酶/信号转导与转录激活子(JAK/STAT)信号通路介导高血糖损伤肾细胞过程，负调控JAK/STAT可有效抑制DKD的发病过程。然而，JAK/STAT信号通路调控自噬进而影响DKD的研究却鲜有报道，亟待进一步阐明。<br>　　因此，我们推测，JAK/STAT信号通路可通过调控自噬相关基因，促进足细胞自噬，进而减轻DKD的足细胞损伤、保护肾功能，CMP的护肾作用可能与此机制有关。为验证上述假说，本项目采用链脲佐菌素(streptozotocin，STZ)诱导DKD小鼠和高糖诱导永生化足细胞损伤模型，明确JAK/STAT信号通路调控自噬相关基因表达在足细胞损伤及DKD疾病发展中的作用，旨在探究JAK/STAT-自噬在CMP保护DKD肾功能中的关键作用，为DKD防治提供新思路。<br>　　目的:<br>　　1.通过研究DKD中JAK/STAT信号通路调控自噬的关系，揭示JAK/STAT信号通路调控自噬活动变化的具体分子机制，拓展DKD的发病机制，为其治疗药物研发提供重要的基础研究。<br>　　2.通过研究在CMP的干预下JAK/STAT-自噬的变化趋势，从JAK/STAT信号通路调控自噬的角度，诠释CMP改善DKD的机制，为DKD防治提供新思路。<br>　　方法:<br>　　1.蛹虫草多糖干预对STZ所致糖尿病肾病模型的肾功能保护研究<br>　　(1)采用热水浸提法提取CMP，得到的多糖采用苯酚-硫酸法检测多糖含量，傅里叶红外光谱仪检测多糖结构，高效液相色谱法检测多糖的组成。<br>　　(2)雄性C57BL/6J小鼠腹腔注射STZ50mg/kg·d-1，连续5天诱导糖尿病肾病模型。在第14周开始，各组分别给予CMP低、高剂量(200mg/kg、400mg/kg)，连续灌胃6周。以小鼠24h尿蛋白，血糖，体重，肾脏系数，血液生化指标:血肌酐(Scr)、尿素氮(BUN)、总蛋白(ALB)、甘油三酯(TG)和总胆固醇(TC)的含量;HE、PAS和Masson染色观察肾组织病理形态学变化;透射电镜观察肾组织超微结构变化;免疫荧光、免疫组化和Western blot法检测desmin的变化;qRT-PCR检测肾组织中IL-1β、IL-6和MCP-1的含量来评价CMP对DKD的治疗作用。<br>　　(3)透射电镜观察肾组织自噬的变化;免疫荧光和Western blot法检测肾脏组织中自噬相关蛋白:LC3、atg5、atg12、beclin1和p62的变化。<br>　　(4)Western blot法检测JAK/STAT通路蛋白:JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STATS和STAT6的表达。<br>　　2.蛹虫草多糖对高糖诱导的足细胞损伤的作用机制研究<br>　　(1)在足细胞实验中，分组如下:NG组（低糖完全培养基）;HG组（葡萄糖为50mM浓度的完全培养基）;CMP(25)组（葡萄糖为50mM浓度的完全培养基+25μg/ml的CMP）;CMP(50)组（葡萄糖为50mM浓度的完全培养基+50μg/ml的CMP）;CMP(100)组(葡萄糖为50mM浓度的完全培养基+100μg/ml的CMP)。MTT法检测高糖诱导足细胞损伤的最佳浓度，Western blot法测定诱导足细胞凋亡的最佳高糖浓度与刺激时间;AnexinⅤ/FITC试剂盒检测细胞凋亡情况;qRT-PCR检测足细胞炎症因子IL-1β、IL-6和MCP-1的含量;足细胞转染自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)观察自噬流情况。<br>　　(2)在足细胞实验中，给予CMP同时加入自噬抑制剂3-MA，Western blot法和免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3、atg5、atg12、beclin1和p62的变化;足细胞转染自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)观察自噬流情况。<br>　　(3)在足细胞实验中，给予CMP同时加入JAK/STAT通路抑制剂Ruxolitinib，免疫荧光法检测足细胞中JAK/STAT通路蛋白STAT2的表达;Western blot法和免疫荧光法检测自噬相关蛋白LC3、atg5、atg12、beclin1和p62的变化;足细胞转染自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)观察自噬流情况。<br>　　结果:<br>　　1.蛹虫草多糖干预对STZ所致糖尿病肾病模型的肾功能保护研究<br>　　(1)苯酚-硫酸法测得CMP浓度为73.55％;红外光谱测得在3289.87cm-1处为多糖O-H的伸缩振动引起的，在2923.56cm-1处有C-H吸收峰，在1100.00cm-1附近有吸收说明多糖含有C-OH的侧基和C-O-C糖苷键;高效液相色谱法结果显示CMP含有甘露糖、鼠李糖、葡萄糖、半乳糖、木糖5种单糖。<br>　　(2)小鼠体重与肾脏系数结果显示，CMP虽对改善DKD小鼠体重无影响，但能够改善DKD小鼠肾脏肿大的情况，降低DKD模型小鼠24h尿蛋白排泄量，降低血清中Scr、BUN、MDA、TC和TG水平，升高ALB的表达水平;HE、PAS和Masson染色结果显示CMP能够减轻肾组织损伤，改善基底膜轻度增生及系膜增生情况;透射电镜结果显示，CMP能够改善DKD小鼠肾小球足细胞足突融合情况;免疫荧光、免疫组化和Western blot法结果显示，CMP能够降低肾组织中desmin的表达;qRT-PCR结果显示，CMP能够降低IL-1β、IL-6和MCP-1mRNA的表达。<br>　　(3)透射电镜结果显示CMP能够促进DKD小鼠的自噬表达;免疫荧光和Western blot法结果显示，模型组的自噬相关蛋白LC3、atg5、atg12和beclin1表达受到明显的抑制，p62的表达升高，给予CMP后，有所改善。<br>　　(4)Western blot法结果显示，模型组的JAK/STAT通路相关蛋白JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5和STAT6的表达都明显增加，给予CMP后，JAK/STAT通路蛋白表达减少。<br>　　2.蛹虫草多糖对高糖诱导的足细胞损伤的作用机制研究<br>　　(1)足细胞实验中，MTT和Western blot法结果显示，足细胞损伤的最佳条件为50mM浓度的葡萄糖刺激48h。流式细胞仪检测结果显示，高糖能够诱导了小鼠足细胞的凋亡，CMP可以降低高糖诱导的足细胞凋亡情况。QRT-PCR结果显示，高糖能够诱导足细胞的炎症因子IL-1β、IL-6、MCP-1的表达，给予CMP治疗能够改善高糖诱导的足细胞炎症损伤;自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染足细胞结果显示CMP可促进高糖诱导的足细胞的自噬流。<br>　　(2)免疫荧光、Western blot法检测足细胞自噬的表达，并利用3-MA抑制剂作为对照组。结果显示，CMP可通过促进足细胞自噬相关蛋白LC3、atg5、atg12和beclin1的表达，降低p62的表达来改善足细胞损伤。自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染足细胞结果显示CMP可促进高糖诱导的足细胞的自噬流改善足细胞损伤。<br>　　(3)免疫荧光、Western blot法检测足细胞自噬的表达，并利用JAK抑制剂Ruxolitinib作为对照组，结果显示，CMP可通过抑制JAK/STAT通路相关蛋白JAK1、JAK2、STAT1、STAT3、STAT5、STAT6的表达促进足细胞自噬改善足细胞损伤。自噬双标腺病毒(mRFP-GFP-LC3)转染足细胞结果显示促进足细胞自噬流的表达改善足细胞损伤。<br>　　结论:<br>　　1.CMP能够改善DKD小鼠的尿蛋白升高情况，肾脏肿大，肾功能损伤以及病理改变，延缓DKD小鼠的发病进展。<br>　　2.体外实验证实了当JAK/STAT信号通路激活能够对自噬水平的变化具有调节作用。抑制JAK后，自噬活动呈现增强趋势，足细胞的凋亡也随之减少，为DKD的病理进展提供了重要的研究视角。<br>　　3.体内外实验证明CMP可以有效防治DKD，CMP可以通过抑制JAK/STAT信号，改善足细胞的自噬水平，减少炎症因子的释放，减轻肾脏损害，为中医药防治DKD提供了新的思路和方法。