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摘要铜(Cu)是植物生长发育必需的微量元素，但过量时会对植物产生毒害。因此植物体必须根据外界环境的变化及时调整Cu离子稳态网络中各组分的表达，来维持体内Cu离子稳态平衡，以保证植物体的正常生长。拟南芥铜转运蛋白(copper transporter)COPT1和COPT2定位于质膜，主要负责Cu的吸收。本论文以拟南芥COPT1和COPT2为研究对象，对其N端和C端结构域在Cu吸收过程中的功能进行研究。主要结果如下:<br>　　采用酵母异源基因功能互补法发现转化COPT1或COPT2的酵母菌株在正常的非发酵培养基(YPEG)上能够完全互补酵母突变体ctr1△ctr3△的生长缺陷。而在缺Cu培养基上，两种转化子的生长均受到抑制，但COPT2转化子的生长被更显著地抑制，暗示与COPT1相比，COPT2对Cu的亲和力较弱。COPT1和COPT2的N端各含有3个与Cu结合的富含Met和His的基序。对COPT1和COPT2的N端分别进行不同程度的缺失突变后转化酵母ctr1△ctr3△，结果显示当仅缺失第1个Cu结合基序时，不管是在正常的还是在Cu缺乏的培养基上，COPT1(△22N)和COPT2(△18N)均能够恢复ctr1△ctr3△的生长。当同时缺失第1个和第2个Cu结合基序时，尽管在正常培养基上，COPT1(△37N)和COPT2(△26N)均能够恢复ctr1△ctr3△的表型，但在Cu缺乏的培养基上，二者均不能完全恢复ctr1△ctr3△的表型。当3个Cu结合基序均缺失时，即使在正常培养基上，COPT1(△43N)和COPT2(△31N)均不能恢复ctr1△ctr3△的表型，表明COPT1和COPT2的N端第3个Cu结合基序对维持二者在正常条件下的Cu吸收功能是至关重要的。对第3个Cu结合基序进行Met逐个缺失突变及点突变发现COPT1的His43和COPT2的His31对二者正常功能的行使是必需的。离子含量检测表明COPT1和COPT2所有突变形式的酵母转化子的Cu离子含量均分别低于COPT1和COPT转化子，其中COPT1(△43N)和COPT2(△31N)转化子中的Cu含量是最低的。对COPT1和COPT2的C端的所有Cys进行突变后发现这些Cys能够促进二者对Cu的吸收。<br>　　对拟南芥突变体copt1-1和copt2-1、copt2-2及双突变体copt1-1copt2-1的表型进行观察，发现这些突变体对Cu过量和Cu缺乏处理的敏感性均与野生型无显著差异。然而对其不同器官的Cu含量测定后发现，copt1-1copt2-1植株的叶片和果荚中的Cu含量低于野生型植株，而根中的Cu含量则显著高于野生型植株。由于Cu和Ag的化学和物理性质极其相似，我们观察了Cu缺乏条件下这些突变体对Ag的响应规律，发现与野生型植株相比，copt2-1和copt2-2与WT具有相似的敏感性，而copt1-1与copt1-1copt2-1的不敏感性增强。定量PCR结果显示Cu或Ag处理后，COPT1和COPT2的表达均下调;Cu缺乏处理时，二者的表达均增强;而在缺Cu及加Ag处理时，仅COPT1表达上调。<br>　　本实验室的前期结果显示Cu处理拟南芥后，COPT1和COPT2蛋白水平随着Cu处理时间的延长逐渐降低。而蛋白酶抑制剂MG132能够抑制Cu诱导的COPT1和COPT2水平的降低。在本研究中我们运用免疫共沉淀技术发现Cu或MG132处理后，COPT1的泛素化水平增加。酵母功能互补实验显示COPT1C端唯一的Lys突变后，在缺Cu培养基上，COPT1(K159R)酵母转化子的生长明显优于COPT1转化子。将COPT2的C端的所有Lys同时突变后，COPT2(K138,13 9,145R)转化酵母的表型与COPT2转化子相比，无明显差异。<br>　　综上所述，尽管COPT1和COPT2对Cu都具有高亲和性，但二者在Cu吸收能力上有差异。COPT1和COPT2N端的第3个Cu结合基序是它们行使正常功能所必需的。另外，拟南芥COPT1可能通过泛素-蛋白酶体途径对其蛋白水平进行调控，进而参与植物Cu稳态的维持。