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摘要扩展青霉(Penicillium expansum)是一种重要的采后病原真菌，能够引起多种果蔬采后腐烂，造成巨大的经济损失。P.expansum产生的棒曲霉素是污染水果及其加工制品的重要真菌毒素，对人和动物具有急性和慢性毒性，严重危害人体健康。因此，研究棒曲霉素生物合成的分子调控机制，对实现从源头上控制棒曲霉素污染，确保果品的品质安全具有重要意义。目前已经明确由15个基因构成的基因簇负责棒曲霉素的生物合成、转运和调控，但其中部分关键基因的功能以及棒曲霉素合成的转运路径和分子调控机制仍不清楚。本研究运用生物化学、分子生物学、蛋白质组学以及细胞生物学等方法，进一步解析了P.expansum棒曲霉素生物合成的分子基础，并系统地研究了棒曲霉素生物合成的分子调控机制。研究结果主要包括以下三个方面:<br>　　1.棒曲霉素生物合成途径关键催化酶的功能:通过原核表达和镍柱亲和层析完成PePatF和PePatD蛋白的表达纯化。利用纯化蛋白进行体外催化分析，结果发现PePatF将phyllostine催化生成neopatulin，PePatD将neopatulin催化生成E-ascladiol，证明PePatF和PePatD分别催化棒曲霉素合成途径的第8步和第9步反应。通过GFP融合技术结合ER-Tracker、FM4-64和DAPI等荧光染料的共定位，发现PePatA、PePatH和PePatI定位于内质网，PePatJ定位于液泡和胞内囊泡，PePatO定位于液泡。此外，通过去除或添加特异信号肽改变催化酶PePatE、PePatH和PePatD的亚细胞定位，证明各催化酶特定的亚细胞分布对棒曲霉素的合成至关重要。<br>　　2.棒曲霉素生物合成的分子调控机制:通过iTRAQ蛋白质组学结合RT-qPCR分析，发现PePatL正调控棒曲霉素合成基因簇中基因的表达。利用酵母单杂交证明PePatL对棒曲霉素合成途径骨架蛋白的编码基因PePatK具有直接调控作用，说明PePatL是基因簇中调控棒曲霉素合成的特异性转录因子。通过亚细胞定位和酵母双杂交分析，发现P.expansum中的全局性调控因子PeLaeA和4个velvet家族蛋白PeVeA、PeVelB、PeVelC和PeVosA都定位于细胞核，且能够形成异源三聚体PeLaeA-PeVeA-PeVelB。利用同源重组的原理构建了各调控基因的缺失突变株，结果发现ΔPeLaeA、ΔPeVeA和ΔPeVelB中棒曲霉素的合成和基因簇基因的表达都受到显著抑制，说明全局性调控因子PeLaeA、PeVeA和PeVelB能够通过调控基因簇中基因的表达来调控棒曲霉素的合成。<br>　　3.PacC-pH信号途径对扩展青霉棒曲霉素生物合成和致病力的调控机制:通过比较不同pH条件下棒曲霉素合成的差异，发现偏酸性环境比碱性环境更利于棒曲霉素的合成。pH-shift实验分析表明环境pH值升高至5.0时，P.expansum中的PePacC-pH信号途径启动，并通过两步蛋白酶切激活转录因子PePacC。利用同源重组的原理构建ΔPePacC突变株，发现突变株中棒曲霉素的合成受到显著抑制。RT-qPCR分析表明ΔPePacC中棒曲霉素合成基因簇的15个基因的表达量都显著下调，说明PePacC通过调控基因簇中基因的表达来控制棒曲霉素的合成。同时，ΔPePacC突变株的致病力也显著降低。通过iTRAQ蛋白质组学分析，发现有126个蛋白的表达量在ΔPePacC与WT之间存在显著差异。对其中8个候选致病因子进行基因敲除，结果发现ΔPeCrt，ΔPeSat和ΔPeGod突变株对苹果和梨的致病力都明显减弱，表明PePacC能够通过调控关键致病基因的表达来调控P.expansum的致病力。此外，对PePacC上游的Pal蛋白进行功能分析，发现PePalA、PePalB、PePalC、PePalF和PePalH均参与了环境pH信号的传递，并对P.expansum的棒曲霉素合成和致病力都具有重要调控作用。<br>　　以上研究结果不仅为深入认知棒曲霉素生物合成的分子基础和调控网络提供了新证据，还为研发精准高效的棒曲霉素控制技术提供了重要的靶基因。