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摘要目的:肝癌是导致人类死亡最常见的恶性肿瘤之一，严重威胁着人类的生命和健康。临床上有多种肝癌的治疗手段，如放疗，化疗和手术切除等。其中放疗手段由于其无创性在肝癌的治疗中占据重要地位，但肝癌的放疗抗性使其治疗效果并不理想。因此探索肝癌放疗抗性的分子机制并开发新的放疗增敏手段是很有必要的。为此，从分子水平对肝癌的辐射抗性进行深入探讨，寻找可能影响肝癌辐射抗性的生物学标志物，明确其调控机制可以为增加肝癌的放疗敏感性提供一定的理论基础，进而提高肝癌的放疗效果和病人的生存周期。<br>　　微小RNA(microRNA)是一种长度约为22个nt，无蛋白编码功能的小RNA，能够在转录后通过结合到靶基因的3'UTR来抑制其转录和翻译。近年来，研究发现miRNA在多种癌症中表达异常，参与调控多项重要的肿瘤细胞生物活动。有研究表明miRNA和细胞的电离辐射应答之间存在紧密联系。因此，对miRNA功能及其机制的研究有可能对提高肿瘤放疗效果提供新的理论依据。我们前期研究发现PER1与肿瘤细胞辐射敏感性相关，在本课题中，我们主要着眼于靶向PER1的miRNAs，拟在分子、细胞和动物水平阐明辐照后肝癌细胞系中miR-214的表达变化以及miR-214对肝癌细胞辐射抗性的影响。<br>　　方法:本研究分为三个部分;(1)PER1蛋白、miR-214和miR-379在肝癌细胞中的表达情况:通过TCGA数据库对肝癌细胞中PER1蛋白、miR-214和miR-37的表达进行分析，同时分析PER1蛋白在肝癌的不同临床分期中的表达情况。用qRT-PCR技术来验证生物信息学的分析结果。相对定量PCR分析肝癌细胞系Smmc-7702、HepG2、BEL-7402和永生化的正常肝细胞系L02中PER1、miR-214和miR-379的表达水平。最后通过TCGA数据库分析不同PER1、miR-214和miR-379的表达对于病人生存周期的影响。(2)电离辐射对PER1蛋白、miR-214和miR-379表达的影响:经过X射线处理后，利用qRT-PCR，Westernblot技术分析PER1、miR-214和miR-379在肝癌细胞系SMMC-7702、HepG2和BEL-7402中的表达变化。(3)miR-214靶向作用PER1增强肝癌细胞的辐射抗性:荧光素酶报告载体技术验证miRNA与PER1之间的相互作用关系。随后在肝癌细胞系中敲低miRNA的表达，观察细胞的凋亡，增殖能力，细胞存活以及皮下移植瘤的生长状况。最后用qRT-PCR、Westernblot验证皮下移植瘤中PER1和miRNA的表达。<br>　　结果:<br>　　1)PER1蛋白、miR-214和miR-379在肝癌细胞中的表达情况:通过TargetScan软件预测，miR-214和miR-379可能靶向结合PER1。利用TCGA数据库分析PER1在蛋白和mRNA水平、miR-214、miR-379在肝癌组织以及癌旁组织的表达情况，并分析在肝癌不同临床分期中PER1蛋白的表达情况，发现肝癌组织中的PER1在蛋白水平的表达明显低于正常的癌旁组织，并且肝癌临床分期越高，PER1蛋白的表达量越低(p＜0.05)。而在肝癌组织中miR-214和miR-379的表达要明显高于癌旁组织(p＜0.05)。qRT-PCR结果显示，不同的肝癌细胞系中PER1蛋白mRNA的表达明显低于永生化的正常肝细胞，与之相反，miR-214和miR-379在肝癌细胞系中的表达明显高于其在正常永生化的肝脏细胞中的表达(p＜0.05)。而在三种肝癌细胞系中，PER1蛋白的表达水平也不一样，BEL-7402中PER1蛋白的表达水平最低，Smmc-7721中PER1的表达水平最高。对PER1、miR-214和miR-379表达不同的病人进行生存分析，我们发现，PER1表达水平高的病人预后生存周期长，相反，表达表达水平低的病人，预后生存周期短(p＜0.05)。而miR-214表达水平较高的病人，生存周期明显低于低表达miR-214的病人(p＜0.05)，但是，miR-379的表达变化对于肝癌病人的生存预后没有显著性差异。<br>　　2)电离辐射对PER1蛋白、miR-214和miR-379表达的影响:我们用不同剂量的X射线处理三种不同的肝癌细胞系，每隔两个小时检测PER1mRNA水平的变化，发现在照射12h后，PER1在三种细胞系中的水平明显升高(p＜0.05)。通过克隆形成实验发现，高表达PER1蛋白的Smmc-7721的克隆形成率明显要高于低表达PER1的BEL-7402(p＜0.05)。同样，我们也检测了miR-214的表达水平，结果发现，在照射后，miR-214表达水平在肝癌细胞系中出现明显的降低(p＜0.05)。同时，我们用之前检测的不同表达水平的肝癌细胞系进行克隆形成实验，结果显示，高表达miR-214的BEL-7402肝癌细胞照射后克隆形成率明显高于低表达水平Smmc-7721的克隆形成率(p＜0.05)。<br>　　3)miR-214靶向作用PER1蛋白增强肝癌细胞的辐射抗性随后我们利用荧光素酶报告载体技术验证miR-214，miR-379与PER1的靶向关系。结果发现转染miR-214mimics后生物发光强度明显降低，但是上调miR-379的表达后生物发光强度并没有降低，反而有所升高(p＜0.05)。我们又通过TargetScan预测的结合位点构建结合位点突变的荧光素酶报告载体，发现在共转染miR-214结合位点突变体和miR-214mimics后荧光素酶活性并没有明显的改变。然后我们通过抑制miR-214的表达来观察PER1蛋白的表达变化，Westernblot结果显示，加入miR-214的抑制剂后，PER1蛋白的表达水平出现明显的升高(p＜0.05)，但是在加入miR-214类似物后PER1蛋白的表达明显降低(p＜0.05)。以上结果表示，PER1蛋白是miR-214的直接靶标分子。根据之前的结果，对miR-214通过靶向PER1来影响肝癌细胞系的辐射敏感性进行验证，结果发现，Smmc-7721和BEL-7402肝癌细胞系在X射线照射以后，其克隆形形成能力降低，但是转染miR-214抑制剂以后，再用X射线照射处理，两种肝癌细胞系的克隆形成能力进一步降低(p＜0.05)。接下来，我们用凋亡试剂盒检测在转染miR-214mimics后，Smmc-7721和BEL-7402两种肝癌细胞系的凋亡情况，结果显示，过表达miR-214以后，X射线照射引起的两种细胞系的凋亡明显降低(p＜0.05)，但是，在miR-214被抑制后，X射线引起的凋亡水平反而升高，并且明显高于对照组(p＜0.05)。最后，我们用HepG2肝癌细胞构建了NOD/SCID小鼠的皮下移植瘤模型，成瘤后在体转染miR-214抑制剂并进行10GyX射线辐照，每隔5天测量一次肿瘤体积并记录。35天之后处死小鼠取出皮下移植瘤并拍照，qRT-PCR和Westernblot检测移植瘤中miR-214和PER1蛋白的表达水平。结果发现，在miR-214抑制剂处理组中，肿瘤体积在照射后增长速度明显低于对照组(p＜0.05)。miR-214抑制剂处理组中的miR-214表达水平明显低于对照组(p＜0.05)。在miR-214抑制剂处理组中PER1蛋白表达水平明显高于对照组(p＜0.05)。我们发现，抑制miR-214表达后，肝癌细胞的辐射抗性明显降低。<br>　　结论:<br>　　(1)在肝癌组织中PER1的表达水平明显低于癌旁组织。并且PER1表达水平与生存周期呈正相关。miR-214和miR-379在肝癌组织中的表达明显高于癌旁组织，高表达miR-214的肝癌患者，生存预后差，miR-379的异常表达对病人生存预后无明显影响。<br>　　(2)电离辐射可以引起PER1蛋白表达的上调，同时miR-214的表达下调。<br>　　(3)miR-214可以通过抑制PER1蛋白的表达来增强肝癌细胞的辐射抗性。