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摘要第一部分X-连锁显性低血磷性佝偻病的临床及分子遗传学研究<br>　　[研究背景]<br>　　X-连锁显性低血磷性佝偻病/骨软化症(X-linked dominant hypophosphatemic rickets/osteomalacia，XLH)由PHEX基因的功能缺失突变导致，其发病率约为3.9-5/100，000，是遗传性低血磷性佝偻病/骨软化症中最常见的类型。目前，现有XLH研究多针对欧美人群，对于中国XLH患者群体的临床及生化特点、PHEX基因突变特征及成纤维细胞生长因子23(fibroblast growth factor-23，FGF23)水平鲜有研究报道。XLH临床表现异质性很大，且该病十分罕见，现有研究受样本量限制，对于XLH是否存在影响疾病表型的相关因素尚无定论。近年来，XLH的一种靶向治疗新药(FGF23单克隆抗体，KRN23)问世，在欧美国家成人及儿童XLH患者中获得了十分理想的治疗效果且安全性良好。进一步明确中国XLH患者的临床特征、分子遗传学特点及FGF23水平等，将为今后中国XLH患者的靶向治疗提供重要临床指导。<br>　　[目的]<br>　　1.本研究基于大样本中国XLH患者人群(261例患者)，旨在明确XLH患者的临床及生化特征、FGF23水平和分子遗传学特征(PHEX基因突变特点)，探究是否存在影响该疾病临床表型异质性的因素。<br>　　2.分析致病基因PHEX突变在DNA水平及蛋白结构水平的分布特征与聚集性，探索PHEX蛋白重要功能结构域。<br>　　[研究方法]<br>　　1.研究对象:回顾性纳入2005年至2017年在北京协和医院确诊的XLH患者。患者纳入标准:(1)通过基因检测明确存在PHEX基因突变;(2)存在XLH的相应临床表现(低磷血症、骨痛、骨骼畸形、身材矮小、X线提示佝偻病或骨软化征象等)。<br>　　2.研究方法:(1)回顾性收集所有初诊尚未接受药物治疗或已中断药物治疗1年以上XLH患者临床、生化及影像学资料并进行统计学分析;(2)Sanger测序法及多重连接探针扩增技术(multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)检测XLH患者PHEX致病突变，并进一步分析突变分布特点;(3)通过同源建模方法构建PHEX蛋白结构模型，在蛋白三维结构水平分析突变聚集性，探索PHEX蛋白是否存在重要功能域;(4)酶联免疫吸附测定(enzyme-linked immunosorbent assay, Elisa)方法检测患者血清中全段FGF23蛋白(intact FGF23，iFGF23)水平，并分析PHEX突变类型/突变位点对XLH患者iFGF23水平的影响;(5)探索XLH疾病表型的影响因素，分析性别、基因突变类型/位点、iFGF23水平等是否影响该疾病临床表型。<br>　　[结果]<br>　　1.本研究共纳入261例于北京协和医院就诊的XLH患者，其中男性84例，女性177例。所有XLH患者均为幼年起病(0-6岁)，平均起病年龄为1.25岁，最常见的起病就诊主诉为下肢弯曲畸形(47.0％)及下肢无力/步态摇摆(29.0％)。<br>　　2.XLH的主要临床特征表现为身材矮小和骨骼畸形。患者的平均身高标准差(standard deviation score，SDS)为-2.74±1.58，其中67.7％患者身高在-2SDS以下，成年患者身材矮小(SDS-3.55±1.44)较青少年患者(SDS-2.40±1.52)更为显著(P＜0.001)。该病最常见的骨骼畸形为下肢畸形(发生率95.9％)，其次为串珠肋(72.1％)和手镯/足镯征(70.3％)。儿童XLH患者骨骼佝偻病评分(rickets severity score，RSS)中位数为6分。XLH典型的生化特征为低磷血症(发生率96.4％)、血碱性磷酸酶水平升高(发生率77.7％)、高PTH血症(发生率59.2％)、β-CTx升高(发生率67.5％)，而血钙及尿钙水平正常。<br>　　3.中国XLH患者人群iFGF23水平中位数为101.9pg/ml，约为正常人群的2.5-5倍，但存在较大个体差异(6.46-542.57pg/ml)，且个体iFGF23水平并不受性别、年龄、PHEX基因突变类型或突变位置等因素的影响(p＞0.05)。<br>　　4.研究纳入的261例XLH患者中共检出166种PHEX基因突变，包括142种点突变(含25种错义突变、36种无义突变、31种微小缺失突变、24种微小插入突变及26种剪接位点突变)和24种大片段插入/缺失突变。其中，111种是文献尚未报道的新突变位点。PHEX突变分布在C-端区域更为聚集，54.6％的突变发生在15-22外显子，第15、20和18外显子的突变发生率高于其他外显子，分别为10.7％，9.6％、9.1％。<br>　　5.通过同源建模方法构建了PHEX蛋白三维结构，并在蛋白结构水平对PHEX突变进行聚集性分析，结果显示无义突变散在分布并无显著聚集性，而错义突变呈聚集性分布，集中分布在蛋白三维结构两侧末端结构域内(98.7％)，尤其是在锌离子结合域附近更为聚集(70.1％)。<br>　　6.分析可能影响XLH疾病表型的相关指标(包括性别、基因突变类型/位点及iFGF23水平)，结果显示除PHEX基因C-端突变(649位氨基酸到3'末端)的患者发病年龄较N-端突变(从5'末端到649位氨基酸)患者稍早(14月龄vs.16月龄)外，性别、iFGF23水平、PHEX基因突变类型或突变位置对XLH患者疾病严重程度(血磷/正常上限比、下肢畸形出现时间、身高(SDS)、佝偻病严重程度评分(RSS)等指标)均未见显著影响(p＞0.05)。<br>　　[结论]<br>　　1.本研究是迄今为止最大的XLH患者队列，明确了中国XLH患者的临床表型特点为身材矮小、下肢畸形、低磷血症、血ALP升高、高PTH血症、β-CTx水平升高及较严重骨骼佝偻病。<br>　　2.XLH患者iFGF23水平升高，但个体异质性较大，iFGF23升高程度并不能代表XLH疾病严重程度。<br>　　3.本研究共发现了166种PHEX基因突变，包含111种未报道突变，极大地丰富了PHEX基因突变库。<br>　　4.PHEX突变聚集性分析显示错义突变在蛋白结构水平呈现一定聚集性，主要集中在蛋白两端结构域内，尤其是锌离子结合区，提示该区域可能为PHEX蛋白的重要功能域。<br>　　5.明确了性别、PHEX基因突变型及iFGF23水平等因素对XLH疾病表型无显著影响作用。<br>　　第二部分高/低剂量活性维生素D联合中性磷治疗儿童XLH的前瞻性、开放、随访研究<br>　　[研究背景]<br>　　X-连锁显性低血磷性佝偻病/骨软化症(X-linked dominant hypophosphatemie rickets/osteomalacia，XLH)患儿常有显著的身材矮小及骨骼畸形，并可能进一步影响患儿心理健康，需要尽早干预。活性维生素D联合磷酸盐治疗具有改善XLH骨骼矿化不良、促进身高生长等获益。然而，目前关于磷和骨化三醇的具体用量缺乏准确的指导意见，推荐的骨化三醇的剂量范围很广，从10-80ng/kg/day不等。有研究提出较高剂量的骨化三醇可能对于改善患儿骨骼佝偻病及促进生长具有更佳疗效，然而骨化三醇过量则会带来高血钙、高尿钙以及肾钙质沉着症的风险增加。目前尚无研究评估系统应用骨化三醇治疗儿童XLH的最佳治疗剂量。<br>　　[目的]<br>　　建立儿童XLH的前瞻性研究队列并进行随访研究，探索使用骨化三醇治疗儿童XLH的最佳有效且安全的治疗剂量，为XLH的规范治疗提供高质量的循证医学证据。<br>　　[对象和方法]<br>　　1.研究对象:2017年7月至今于北京协和医院就诊的儿童XLH患者，纳入标准:(1)临床诊断为XLH，患者有低磷血症、骨痛、骨骼畸形、身材矮小、骨骼X线提示佝偻病等表现;(2)明确遗传学诊断(PHEX基因突变);(3)年龄在1-12岁，青春发育期前儿童患者。<br>　　2.研究方法:<br>　　(1)本研究设计为单中心、前瞻性、开放标签的双臂随机临床对照实验，进行高/低剂量活性维生素D联合中性磷治疗儿童XLH的入组及随访研究。对所有入组患者进行临床资料收集、血标本采集、致病基因PHEX突变检测，进行骨化三醇剂量随机分组(高剂量40ng/kg/day，低剂量20ng/kg/day)，中性磷使用剂量固定(均采用30mg/kg/day)。采用滴定剂量法对骨化三醇药物剂量进行调整，以调整至最适宜剂量(即在安全用药范围内，最大程度改善及缓解佝偻病)。入组后第3、6、12、18、24个月时进行随访，进行疗效评估及不良反应监测，并据此进行骨化三醇用药剂量调整。<br>　　(2)对2017年7月至2019年4月期间入组本研究并已完成12个月随诊的患者，进行了疗效及不良反应的初步评估。<br>　　[结果]<br>　　1.本研究建立了中国首个儿童XLH患者的入组及随访研究队列。截至2019年4月，已入组儿童XLH患者110例，是现已知国内外最大的XLH儿童前瞻性研究队列。通过本研究制定了完善的XLH患儿入组标准及随诊流程，定期进行完善的疗效评估、不良反应监测及药物滴定剂量调整。<br>　　2.对高/低剂量骨化三醇联合中性磷治疗12个月的儿童XLH患者的疗效及安全性进行了初步评估。疗效评估方面，高剂量骨化三醇治疗组患儿骨骼佝偻病评分(RSS)由7分改善至5分，低剂量治疗组由6分改善至5分，虽然高剂量组RSS改善较低剂量组有更为明显的趋势，但两组间疗效比较无显著统计学差异(p=0.281)。高/低剂量治疗组患儿身高增长(cm)分别为6.19±1.74cn及6.03±1.70cm，两组间比较无显著差异(p=0.727)。高剂量治疗组有38％的患者牙周脓肿情况有所改善，而低剂量组仅有22％的患者牙周脓肿获得改善。高剂量治疗组患儿血清PTH水平显著下降(p=0.004)，而低剂量治疗组患儿血清PTH水平未见显著改变(p=0.089)。安全性评估方面，高/低剂量骨化三醇治疗前后尿钙水平均无显著变化(高剂量组vs.低剂量组，p=0.987vs.p=0.629)，两组间未见显著统计学差异(p=0.821)，且治疗过程中未见明显的胃肠道不适反应。<br>　　[结论]<br>　　本研究得出初步结论，采用高剂量骨化三醇(40 ng/kg/day)联合中性磷治疗儿童XLH患者可能在牙周疾病及高PTH血症的改善方面有更好的疗效，且不增加治疗过程中高尿钙及胃肠道不适等不良反应的发生，安全性良好。治疗对于患儿碱性磷酸酶水平及生长速度的改善还有待更长时间随访研究进一步证实。本研究为儿童XLH治疗使用骨化三醇的最佳治疗剂量提供了有力循证医学证据及理论支持。