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摘要本草基因组学(Herbgenomics)是利用组学技术研究中药基原物种的遗传信息及其调控网络，从组学水平研究中药及其与人体相互作用，阐明中药预防和治疗人类疾病的分子机制的前沿学科，其主要研究内容涉及理论体系、关键技术及实践应用等方面。本研究将DNA条形码鉴定、宏基因组测序和单分子测序等关键技术应用于中药鉴定领域，构建长白山区药用植物DNA条形码数据库并建立中成药质量控制新方法。中药材DNA条形码分子鉴定需要强大的数据库作为支撑，并持续进行数据更新、扩充及维护;中成药质量参差不齐，《中国药典》现行方法难以满足当前对中成药生物组分监测需求，因此迫切需要建立中成药质量评价新方法。本研究基于本草基因组学的关键技术，采用不同测序平台对长白山区药用植物及中成药进行鉴定，主要研究内容及结论如下:<br>　　1.建立长白山区药用植物DNA条形码数据库:长白山区是北半球同纬度地区保存比较完好的生态系统，是我国北方药用植物资源分布较为集中的区域，也是东北亚地区最大的药用植物种质基因库。对长白山区药用植物资源进行调查，共收集来自107个科400个属678个物种总计1，877份样本。有19个属采集到5个以上物种，随机筛选其中8个属共计55个物种158份样本，比较ITS2、psbA-trnH、matK和rbcL四种最常用DNA条形码序列的鉴定效率，确定以ITS2和psbA-trnH序列为主体构建长白山区药用植物DNA条形码数据库。实验获得ITS2、psbA-trnH序列各1，736条、1，665条，均经BLAST比对判定其准确性，并纳入上述数据库。该数据库是基于国家自然保护区建立的首个药用植物DNA条形码数据库，能为用户提供长白山区分布药用植物基本信息检索、DNA条形码序列BLAST比对及物种鉴定等功能，对于保护长白山区生物多样性具有重要意义。与“中药材DNA条形码鉴定系统”相比，本研究收集的样本中有38.3％的物种(264种)为新增物种，能够丰富现有DNA条形码数据库，更好地发挥中药材DNA条形码分子鉴定技术对中药材流通市场的监管作用，为海关出入境检验检疫及食品药品监督管理机构提供有效工具，从源头保证临床用药安全。<br>　　2.建立基于鸟枪法宏基因组测序的中成药生物组分监测方法:收集龙胆泻肝丸处方各味药材作为对照，经性状鉴别及DNA条形码鉴定以确保对照药材均为正品;依照《中国药典》规定方法在实验室自制龙胆泻肝丸对照样本2份(RF01-02)，RF02加入人参作为阳性对照;另购买3份市售样本(LDXGW01-03)。分别提取上述样品基因组DNA，构建PCRFree文库，采用IllurninaHiSeq2500平台进行鸟枪法宏基因组测序。原始数据过滤后去除低质量测序reads，高质量测序reads比对ITS2、psbA-trnH和matK数据库，成功比对的测序reads拼接后，获得待检中成药样品DNA条形码序列;在“中药材DNA条形码鉴定系统”中对所得序列进行BLAST比对，获得物种鉴定结果;此外，依照《中国药典》规定方法对龙胆泻肝丸有效成分进行薄层色谱鉴别及含量测定。本研究共获得100G原始数据，经拼接过滤后得到261个对照及市售样品ITS2，psbA-trnH和matK序列contig。分析结果显示ITS2序列鉴定效率最高，2份对照样本均能够成功检出龙胆泻肝丸处方规定的全部物种，且RF02能够检出阳性对照药材人参，证明该方法具备良好的准确性、稳定性和重复性。市售样品经薄层色谱鉴别及含量测定均符合《中国药典》规定，然而宏基因组测序结果显示市售样品采用川木通药材(Clematidis Armandii Caulis)替代处方规定的木通药材(Akebiae Caulis)。综上，基于鸟枪法宏基因组测序的中成药生物组分监测方法，能够精准监测中成药物种组成，是对复杂组方中成药质量控制方法研究的新突破。<br>　　3.建立基于SMRT测序的中成药生物组分监测方法:购买九味羌活丸组方各味药材作为对照，经性状鉴别及DNA条形码鉴定以确保对照药材均为正品。依照《中国药典》规定方法将上述中药材粉碎并混合均匀，制成九味羌活丸对照样本2份(RF01-02)，RF02加入人参作为阳性对照;购买3份市售样本(JWQHW01-03)。提取上述样品基因组DNA，扩增其ITS2和psbA-trnH序列，扩增产物经纯化后进行SMRT测序及数据分析，所得序列在“中药材DNA条形码鉴定系统”中进行物种判定。SMRT测序共获得518.6M数据，经过滤后获得可用于后续分析的ITS2和psbA-trnH序列环状一致性测序reads(CCS reads)分别为5，416条和4，342条。物种判定结果显示2份对照样本均能够检出组方中除苍术、白芷外的七味药材，与Sanger测序结果一致，且RF02检出阳性对照药材人参，显示该方法具备良好的准确性、稳定性和重复性。市售样本JWQHW01-03均未检出地黄、白芷，此外，JWQHW02还未检出黄芩;研究还发现，市售样本ITS2和psbA-trnH序列CCSreads比对到27科47属和12科18属其他物种，如JWQHW02中检出白术(Atractylodes macrocephala)，而当归属(Angelica)、前胡属(Peucedanum)物种在市售样本中均被检出，显示该方法能够有效检出混淆品及其他杂质。本研究表明该方法适用于中成药生产加工全流程的质量监控，为修订中成药质量控制方法提供新思路，推进《中国药典》中成药质量标准研究。