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摘要传统的放疗和化疗在杀伤肿瘤细胞的同时，对正常细胞也有较大损伤，导致病人预后不良以及生存质量下降。因此，研发精准靶向肿瘤细胞的治疗方案迫在眉睫。肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体(Tumor necrosis factor related apoptosis-inducing ligand，Apo2L/TRAIL)属于TNF超家族，是天然抗肿瘤免疫反应的重要成分之一。它通过作用于激活型受体DR4(Death Receptor 4)和DR5(Death Receptor5)，特异性诱导肿瘤细胞凋亡，而对正常细胞没有损伤，该特征使其有潜力成为理想的抗肿瘤药物。然而，重组可溶型TRAIL以及多种TRAIL受体激动剂在临床试验中无论单用还是和其他化疗药物联用，均未获得令人满意的临床疗效。因此对TRAIL进行增效改造，成为相关研究领域的必然趋势，其中构建TRAIL融合蛋白是常用的手段之一。<br>　　我们采用不同的策略，设计四种融合方案，构建了八种全新的TRAIL融合蛋白，经文献检索，这些新型融合蛋白属于首次构建。经表达、纯化和复性，可获得有活性的融合蛋白产物，利用MTT实验对它们的体外抗肿瘤活性进行检测和筛选，希望获得具有优秀抗肿瘤活性的TRAIL。其中，融合有EGFR(epidermal growth factor receptor)亲和多肽TGF3L(the3rdloopoftumorgrowthfactorα，TGF3L)的“双靶向”TRAIL融合蛋白活性增强最为显著，其对肿瘤的杀伤作用相对于TRAIL可提高数百至数千倍，特别是在人结肠癌细胞Colo205和人乳腺癌细胞MDA-MB-468中，其LC50相对于TRAIL分别降低了3，000倍和1，000倍，并且对非肿瘤细胞没有损伤。因此，我们对TGF3L-TRAIL融合蛋白活性增强的机制进行了深入探索。<br>　　为探究TGF3L-TRAIL的EGFR靶向性和凋亡诱导活性，我们进行了受体结合、抗体阻断、凋亡检测、caspase酶活性检测等实验。结果表明，TGF3L-TRAIL对EGFR并没有明显的亲和力。TGF3L-TRAIL能以不同于TRAIL的模式激活DR4和DR5，并能高效活化caspase-8/3，诱导肿瘤细胞凋亡。我们发现TGF3L-TRAIL能够自发组装成一种稳定的高聚体，分子量约为0.8～5×106Da。该高聚体的形成依赖于金属离子、His-tag和TGF3L短肽的协同作用。并且，TGF3L-TRAIL抗肿瘤活性的增强，高度依赖于该聚体的形成。在Colo205移植瘤模型中，TGF3L-TRAIL表现出优于TRAIL的体内抗肿瘤活性。<br>　　我们尝试将一种来源于人铜离子转运蛋白(human copper transporter 1，CTR1)的金属亲和性短肽—NCTR25，替代上述TGF3L-TRAIL的N-端His-tag人工标签，构建NCTR25-TGF3L-TRAIL和NCTR25-TRAIL两种新型融合蛋白。它们与His-TGF3L-TRAIL一样，可形成稳定的分子量为107-108Da的高聚体，高聚体的形成同样依赖于金属离子，并具有比TRAIL增强10，000-20，000倍的肿瘤细胞选择性杀伤毒性和有效的体内抗肿瘤活性。NCTR25-TRAIL具有与NCTR25-TGF3L-TRAIL同样的理化特征及生物活性，这说明TGF3L多肽对TRAIL高聚体的形成以及活性的增强并非不可或缺。以这两种TRAIL高聚体为工具，我们研究了多价配体对受体激活和信号转导的特征，发现这两种高聚体TRAIL可特异性激活DR4和DR5而非其他TNFRSF受体;高聚体TRAIL对受体亚型的选择性不同于TRAIL，且这种选择性可能因细胞种类差异而表现不同;它们能以更高的效价强度激活caspase通路、诱导肿瘤细胞的凋亡，但最大效能与TRAIL类似，这与文献报道一致;而在活化NF-κB信号通路时，多聚体TRAIL不但具有更高的效价强度，还具有更高的效能，这是我们的首次发现;TRAIL以及高聚体TRAIL均主要通过DR5介导NF-κB的活化。<br>　　综上所述，我们成功构建并制备了多种新颖的TRAIL融合蛋白;发现三种新型TRAIL融合蛋白能够自发形成高聚体，具有极高的体外活性;这些多价TRAIL配体具有专一的受体选择性，在激活相关信号通路时，表现出比TRAIL更高的效价强度，并首次观察到多价配体具有比TRAIL更高的效能。本研究为新型抗肿瘤蛋白质药物的开发奠定了实验和理论基础;将人源金属亲和短肽与TRAIL融合，可能作为一种新的策略用于开发更高效的蛋白质药物。