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摘要目的:调节性T细胞(Treg)是具有抑制免疫反应和免疫自稳功能的一类T细胞亚群，通过发挥免疫调节功能而防止自身免疫病的发生。Treg细胞保证其谱系特性的核心是持续的Foxp3蛋白表达和发挥免疫抑制功能。探索维持Treg谱系稳定性的调控网络，具有重要的理论价值和临床应用前景。研究发现Lkb1可通过控制T细胞发育及活化以维持机体免疫平衡，而对Lkb1在Treg中的功能机制研究仍是一片空白。我们的前期数据发现在TCR刺激下Treg胞内Lkb1蛋白水平上调，提示Lkb1可能在调控Treg免疫调节功能中发挥作用。本研究将探索Lkb1对Treg细胞生物学功能及免疫平衡的调控作用及其分子机制，为临床上免疫性疾病的治疗策略提供科学依据。<br>　　方法:构建Treg特异性Lkb1敲除小鼠(Foxp3Cre-YFPLkb1f/f);观察野生型(Foxp3Cre-YFP，WT)及Lkb1条件敲除(cKO)小鼠一般体征，分析淋巴器官和细胞特征、各器官病理及观察生存期;流式细胞术检测小鼠T细胞极化和活化情况，Treg比例、数量、凋亡水平、细胞周期分析及转录因子磷酸化水平;构建Foxp3CreAMPKa1f/fAMPKa2f/f条件性敲除小鼠验证Treg中Lkb1缺失所致的小鼠表型是否由经典下游分子AMPK介导;分别构建Foxp3CreLkb1f/fRosa26YFP谱系示踪小鼠模型和WT，cKOTreg细胞竞争性过继回输模型检测Treg细胞Foxp3表达稳定性;构建ERT2CreLkb1f/fRosa26YFP小鼠验证Lkb1瞬时敲除对Treg中Foxp3表达的影响，同时用Foxp3Cre/+Lkb1f/f无明显免疫活化的雌性小鼠(体内约1/2的Treg为Lkb1敲除型，剩余为野生型Treg)验证Lkb1缺失所致的Foxp3表达变化是否为内源性机制调控;分别在转录因子STAT5、6、3、4对应的上游细胞因子IL-2，IL-4，IL-6或IL-12刺激下，体外培养检测Treg中Foxp3表达变化;重亚硫酸盐处理检测Foxp3CNS2区DNA甲基化水平;免疫共沉淀检测转录因子STAT4与甲基化转移酶DNMT1、DNMT3的结合情况;染色质免疫共沉淀实验检测转录因子STAT4、STAT5在Foxp3CNS2区的结合情况。<br>　　结果:Foxp3Cre-YFPLkb1f/f小鼠出生后40天内死亡，并表现为脾脏和全身外周淋巴结明显肿大、各器官有大量炎症细胞浸润;Foxp3Cre-YFPLkb1f/f小鼠淋巴器官Treg比例明显低于野生型小鼠，CD4+、CD8+常规T细胞增殖、活化增加，并表现为向Th1、Th17分化增加;Foxp3CreLkb1f/fRosa26YFP小鼠淋巴器官中约有70％的Treg细胞不再表达Foxp3;Foxp3CreAMPKa1f/fAMPKa2f/f小鼠并未表现出Foxp3Cre-YFPLkb1f/f小鼠的上述T细胞表型;体外将Foxp3Cre-YFPLkb1f/f中的Treg与树突状细胞(Dendritic cell, DC)共培养，在IL-2+IL-12刺激下可诱导Lkb1缺陷的Treg中Foxp3表达关闭，而野生型则能维持表达;Lkb1缺陷Treg中Foxp3的转录调控元件保守非编码区2(conserved noncoding sequence 2，CNS2)DNA甲基化水平相比野生型上调;Lkb1缺失的Treg中转录因子STAT4磷酸化水平升高;STAT4可与甲基化转移酶DNMT1结合，同时STAT4可与Foxp3的CNS2区结合，甲基化抑制剂可逆转Lkb1缺失Treg中的Foxp3表达及CNS2甲基化。<br>　　结论:<br>　　1.Treg中Lkb1缺失会导致小鼠致死性自身免疫病;<br>　　2.Lkb1可维持Treg中Foxp3的表达和Foxp3CNS2区的DNA去甲基化;<br>　　3.Treg中Lkb1的功能并不依赖下游分子AMPK介导;<br>　　4.Lkb1抑制Treg中STAT4活化及与Foxp3CNS2区DNA结合;<br>　　5.STAT4活化后可与DNMT1结合并促进Foxp3CNS2区DNA甲基化。