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LncRNA Gm2691、新型AMPK激动剂GSK621减轻心肌缺血再灌注损伤的作用及机制研究

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摘要论文Ⅰ：长链非编码RNAGm2691通过激活PI3K/Akt信号通路减轻心肌缺血再灌注损伤 　　研究背景： 　　急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)是世界范围内导致死亡的主要原因之一。及时再灌注策略，如药物溶栓和经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)已大大改善了AMI患者的预后。然而，心肌细胞缺血一段时间后，冠状动脉血流的恢复往往会导致进一步的组织损伤，这种现象称为心肌缺血再灌注损伤(myocardial ischemia reperfusion injury，MIRI)。心肌损伤可导致严重的临床后果，如无复流现象，心肌收缩性功能不可逆和可逆丧失，再灌注性心律失常，包括致命的室性心律失常等。另外MIRI可引起高达50％的成功实施PCI的患者出现微循环障碍，严重影响治疗效果及患者预后，因此如何减轻MIRI成为冠心病领域研究的重点及热点问题。 　　lncRNAs是一类长度大于200nt的非编码RNA，是继microRNA后发现的又一种细胞内源性的RNA分子。他们参与了细胞的许多生物学过程，如调控蛋白质编码基因，维护基因组的完整性，X染色体失活，基因组印记，转录后调节，细胞分化和发展等。LncRNAs在各种正常生理和病理条件中起重要作用，参与神经系统发育、新陈代谢和癌症发生发展等过程。近年的研究表明LncRNAs具有对多种心脏疾病的调节作用，如扩张型心肌病、心力衰竭、冠状动脉粥样硬化、心肌梗死等。 　　最近一项研究利用转录组芯片技术筛选小鼠缺血后早期再灌注心肌组织lncRNAs差异表达谱，筛选出与缺血再灌注损伤相关的100多个lncRNA，其中lncRNAGm2691在梗死心肌中表达量显著降低，提示lncRNAGm2691可能为缺血再灌注损伤心肌保护的新靶点。 　　本课题旨在探讨lncRNAGm2691减轻缺血再灌注损伤，保护心肌细胞的作用及具体机制。 　　目的： 　　1.阐明lncRNAGm2691抗炎、抗凋亡的作用及其对缺血再灌注诱导的心肌损伤的保护作用。 　　2.探讨lncRNAGm2691是否通过PI3K/Akt信号通路发挥其保护作用。 　　研究方法： 　　一、体内实验 　　1.建立大鼠在体心肌缺血再灌注模型 　　将雄性Wistar大鼠40只，随机分为假手术组(Sham)、缺血再灌注组(I/R)、缺血再灌注+lncRNAGm2691过表达重组腺病毒组(I/R+Ad-Gm2691组)，缺血再灌注+空载体病毒组(I/R+Ad-con组)4组，每组10只。通过开胸结扎冠状动脉前降支30分钟，松开结扎线再灌注180分钟的方法，建立在体心肌缺血再灌注损伤模型。手术前7天心脏注射过表达lncRNAGm2691基因重组腺病毒及阴性对照病毒。Sham组大鼠只穿线不接扎。 　　2.TTC染色法测定缺血再灌注后大鼠的心肌梗死面积。 　　3.检测血清LDH的含量。 　　4.超声检测心肌动力学的改变。 　　5.蛋白印迹法(western blot，WB)检测凋亡相关蛋白Caspase3、Bax、Bcl-2的表达。 　　6.RT-PCR检测炎症因子IL-6、TNF-a和IL-8的表达。 　　二、体外 　　1.分离培养大鼠乳鼠心肌细胞(neonatal rat ventricular cardiomyocytes，NRCMs)，实验分为以下五组:(1)空白对照组(normoxia组):心肌细胞在常氧条件下培养;(2)模型组(hypoxia组):心肌细胞缺氧10小时后复氧4小时;(3)模型组+空载体组(hypoxia+Ad-con组):心肌细胞转染阴性对照腺病毒后，缺氧10小时后复氧4小时;(4)模型组+lncRNAGm2691腺病毒组(hypoxia+Ad-Gm2691组):心肌细胞转染过表达lncRNAGm2691腺病毒后，缺氧10小时后复氧4小时。(5)模型组+lncRNAGm2691腺病毒+PI3K/Akt抑制剂组(hypoxia+Ad-Gm2691+LY294002组):心肌细胞转染过表达lncRNAGm2691腺病毒后，加入浓度为20μmol/LLY294002，缺氧10小时后复氧4小时。 　　2.TUNEL法检测心肌细胞凋亡水平。 　　3.WersternbIot检测Akt、ERK1/2蛋白及凋亡相关蛋白Caspase3、Bax、Bcl-2表达。 　　4.qRT-PCR检测lncRNAGm2691及炎症因子IL-6，TNF-a和IL-8的表达 　　结果： 　　1.LncRNAGm2691减少I/R大鼠心肌梗死面积 　　与I/R组相比，I/R+Ad-Gm2691组心肌梗死面积明显减少(P=0.000)，而I/R+Ad-con组与I/R组相比心肌梗死面积无显著差异(P=0.294)。 　　2.LncRNAGm2691改善I/R大鼠心功能 　　与Sham组相比，I/R组左室收缩期内径(LVIDs)、左室舒张期内径((LVIDd)、左室舒张末期容积(LVEDV)、左室收缩末期容积(LVESV)明显增加(均P＜0.01)，左室射血分数(LVEF)和左室缩短分数(FS)显著下降((均P=0.000)。与I/R组相比，I/R+Ad-Gm2691组LVIDs、LVIDd、LVEDV、LVESV显著降低(均P＜0.01)，LVEF、FS显著升高(均P=0.000)。而I/R+Ad-con组与I/R组相比上述指标无显著差异(均P＞0.05)。 　　3.LncRNAGm2691降低I/R大鼠血清LDH水平 　　I/R组大鼠血清LDH水平明显高于Sham组(P=0.002)，I/R+Ad-Gm2691组LDH水平显著低于I/R组(P=0.031)，I/R+Ad-con组与I/R组无显著差异(P=0.487)。 　　4.LncRNAGm2691降低I/R大鼠心肌组织凋亡相关蛋白表达 　　Western-blot结果显示:相比Sham组，I/R组的Caspase-3及Bax的表达显著升高，Bcl-2的表达显著降低，相应的Bax/Bcl-2比值显著升高(均P＜0.01);与I/R组相比，I/R+Ad-Gm2691组Caspase-3及Bax的表达显著降低，Bcl-2的表达显著升高，Bax/Bcl-2比值显著降低(均P＜0.05)。而I/R组和I/R+Ad-con组之间几乎没有差异(均P＞0.05)。 　　5.LncRNAGm2691有效减少I/R大鼠心肌炎症因子的水平 　　RT-PCR结果显示:与Sham组相比，I/R组心肌组织的IL-6，TNF-a和IL-8mRNA的表达显著升高(均P=0.000);与I/R组相比，I/R+Ad-Gm2691组上述炎症因子mRNA表达明显降低(均P＜0.05)。而I/R组和I/R+Ad-con组之间几乎没有差异(均P＞0.05)。 　　6.腺病毒转染可以增加体外培养的大鼠乳鼠心肌细胞(NRVMs)中lncRNAGm2691的表达 　　结果提示用过表达lncRNAGm2691腺病毒预处理6小时后，缺氧诱导的NRVMs中lncRNAGm2691的表达呈时间依赖性变化，缺氧后3小时lncRNAGm2691的表达即显著升高，并在缺氧后9小时达到峰值。缺氧可导致心肌细胞中lncRNAGm2691的表达降低，而缺氧前用过表达lncRNAGm2691腺病毒预处理6h可显著增加lncRNAGm2691的表达(均P＜0.01)。 　　7.LncRNAGm2691有效减少缺氧/复氧造成的心肌细胞凋亡 　　TUNEL染色显示过表达lncRNAGm2691腺病毒预处理可明显抑制缺氧/复氧过程诱导的心肌细胞凋亡(P=0.002);Western-blot结果显示，相比正常组，hypoxia组的Caspase-3及Bax的表达显著升高，Bcl-2的表达显著降低，相应的Bax/Bcl-2比值显著升高(均P＜0.01);与hypoxia组相比，hypoxia+Ad-Gm2691组Caspase-3、Bax的表达显著降低，Bcl-2的表达显著升高，Bax/Bcl-2比值显著降低(均P＜0.05)。而hypoxia组和hypoxia+Ad-con组之间几乎没有差异(均P＞0.05)。 　　8.LncRNAGm2691有效减少缺氧/复氧造成的心肌细胞炎症因子的表达 　　RT-PCR结果显示:与正常组相比，hypoxia组的IL-6、TNF-a和IL-8mRNA的表达显著升高(均P=0.000);与hypoxia组相比，hypoxia+Ad-Gm2691组上述炎症因子mRNA表达明显降低(均P＜0.05)。而hypoxia组和hypoxia+Ad-con组之间没有显著差异(均P＞0.05)。 　　9.LncRNAGm2691通过PI3K/Akt信号转导通路发挥其对缺氧/复氧造成的心肌细胞损伤的保护作用 　　Western-blot结果表明，与正常组相比，hypoxia组的p-Akt的表达显著降低(P=0.000)，p-ERK1/2的表达显著升高(P=0.005);与hypoxia组相比，lncRNAGm2691过表达显著升高p-Akt的表达水平(P＜0.01)，而对p-ERK1/2的表达无显著影响(P=0.804)。在lncRNAGm2691过表达的基础上，加入PI3K-Akt通路的抑制剂LY294002后，lncRNAGm2691抑制缺氧/复氧造成的心肌细胞凋亡及炎症因子表达的作用明显减弱(均P＜0.05)。 　　结论： 　　1.大鼠心肌缺血再灌注可造成心肌细胞凋亡、炎症因子释放增加，lncRNAGm2691在梗死心肌组织中表达下降，腺病毒介导的lncRNAGm2691在心肌组织的过表达可以减少炎症因子的表达，减轻细胞凋亡，显著减少大鼠心肌缺血再灌注引起的心功能下降、心肌组织坏死。 　　2.LncRNAGm2691过表达可以减少体外培养的原代大鼠乳鼠心肌细胞炎症因子的表达及细胞凋亡，PI3K/Akt信号通路介导lncRNAGm2691的心肌保护作用。 　　论文Ⅱ：GSK621通过激活AMPK信号通路减轻氧糖剥夺/复氧引起的心肌细胞损伤 　　研究背景： 　　腺苷酸活化蛋白激酶(AMP-activated protein kinase，AMPK)是细胞和全身能量稳态的关键调节因子，当细胞能量耗尽时，其发挥恢复能量平衡的作用。在过去的20年里，AMPK被发现能够调控多种细胞功能，在心血管组织中起调节心脏代谢和收缩功能，以及促进血管组织抗收缩、抗炎、抗动脉粥样硬化等作用，被认为是未来代谢性疾病及心血管疾病治疗的重要靶点之一。近年研究发现，AMPK可通过其以上作用，在心肌缺血-再灌注损伤中发挥保护作用。因此开发出能够在心肌组织中激活AMPK的高选择性、高特异性药物，可能成为减少缺血再灌注损伤有效的治疗策略。 　　为了直接有效地靶向激活AMPK，最近有研究者开发了一种噻吩吡啶衍生复合物——GSK621。体外实验发现其能持续激活AMPK。在细胞分析中，乙酰辅酶A羧化酶(acetyl-CoA carboxylase，ACC)磷酸化水平测定表明，GSK621相比其他AMPK激动剂如A-769662，诱导AMPK活化的能力更强。GSK621显著增加AMPK活化的标记物AMPKαT172的磷酸化，同时也刺激了AMPK下游因子ACC(S79)和ULK1(S555)的磷酸化，这些结果表明GSK621是直接的强效的AMPK激活剂。随后的一项研究发现GSK621可以增加成骨细胞中烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADPH)含量，抑制H2O2诱导的活性氧(ROS)生成，诱导细胞保护性自噬，显著减弱了H2O2诱导的细胞死亡和凋亡。然而GSK621能否对心肌细胞缺血再灌注损伤起到保护作用至今尚未见报道。本研究拟探讨GSK621对氧糖剥夺/复氧(oxygen glucose deprivation-re-oxygenation，OGD/R)引起的心肌细胞损伤的保护作用及作用机制。以期对AMPK及其新型激动剂GSK621对心肌细胞保护作用进行阐明，为以AMPK为靶点的药物研发提供新的依据。 　　目的： 　　1.明确GSK621能否激活心肌细胞中AMPK。 　　2.探讨GSK621能否抑制氧糖剥夺/复氧引起的心肌细胞氧化损伤及凋亡。 　　3.阐明GSK621对氧糖剥夺/复氧引起的心肌细胞保护作用是否通过诱导AMPK活化产生，并进一步探讨其下游信号分子Nrf2在其中的作用。 　　研究方法： 　　1.建立AC16人心肌细胞及大鼠乳鼠心肌细胞氧糖剥夺/复氧(OGD/R)模型 　　将上述两种细胞分为对照组、氧糖剥夺/复氧组(OGD/R)、GSK621各种剂量组(OGD/R+0.5μMGSK621、OGD/R+2μMGSK621、OGD/R+5μMGSK621、OGD/R+10μMGSK621)。以100，000个/孔铺6孔板，用的是DMEM高糖培养基，24小时以后模型组换成DMEM无糖培养基，放入厌氧罐内密闭，37℃恒温培养箱中孵育4小时。4小时后，将细胞取出复氧，并换成DMEM高糖培养基，行下一步检测。 　　2.CCK-8法检测OGD/R后各组心肌细胞的活力。 　　3.通过测定培养基乳酸脱氢酶(LDH)含量，检测细胞死亡。 　　4.细胞凋亡检测:包括caspase-3活性检测，ELISA法检测抗单链DNA抗体(ssDNA)，TUNEL染色和AnnexinV/PI流式细胞仪细胞凋亡检测方法。 　　5.Westernblotting检测AMPKα1、p-AMPKα1、ACC、p-ACC、Cle-caspase-3、Cle-caspase-9、Cle-PARP、Nrf-2、HO1、NQO1等表达。 　　6.AMPK活性检测。 　　7.氧化应激ROS检测。 　　8.TBARS法测定细胞内脂质过氧化物含量。 　　9.JC-1法测定各组心肌细胞OGD/R后线粒体的电势。 　　10.实时定量PCR检测Nrf-2、HO1、NQO1等mRNA的表达。 　　11.利用AMPKα1shRNA转染，沉默细胞内AMPK表达后，再次检测细胞活力、凋亡等变化。 　　12.利用crispr/cas9基因编辑法敲除AMPKα1，再次检测细胞活力、凋亡等变化。 　　13.利用Nrf2shRNA转染，沉默细胞内Nrf2表达后，再次检测下游HO1等表达及细胞活力、凋亡等变化。 　　结果： 　　1.GSK621激活心肌细胞中的AMPK信号 　　Westernblot检测证实GSK621(2-10μM)以剂量依赖的方式诱导磷酸化AMPKα1(Thr-172)和其相关代谢通路的下游靶分子乙酰辅酶A羧化酶(ACC，Ser-79位点)表达(均P＜0.01)。GSK621呈剂量依赖性增加细胞内AMPK活性(P=0.000)。 　　2.GSK621抑制氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导的心肌细胞毒性 　　CCK-8细胞活性检测实验显示，氧糖剥夺/复氧(OGD/R)诱导心肌细胞存活率显著下降，LDH释放量明显增加(均P=0.000)。2μM和10μMGSK621预处理，显著抑制OGD/R诱导的细胞存活率降低及LDH释放(均P=0.000)。进一步研究表明，OGD/R组线粒体电势明显下降，caspase-3活性增加，westernblot显示caspase-3、caspase-9和PARP剪切体显著增加，ELISA显示单链DNA(ssDNA)增加，TUNEL染色显示凋亡细胞增加(均P=0.000)。GSK621(2μM和10μM)预处理显著抑制OGD/R-诱导的心肌细胞凋亡;流式细胞术分析结果进一步证实了GSK621可显著降低OGD/R诱导的心肌细胞凋亡(均P=0.000)。 　　3.GSK621抑制OGD/R诱导的心肌氧化损伤 　　OGD/R显著诱导心肌细胞ROS产生和脂质过氧化(均P=0.000)，这种作用被GSK621(2μM和10μM)预处理显著减弱(均P＜0.01)。 　　4.AMPK活化介导GSK621诱导的心肌细胞保护作用。 　　为了证明GSK621对OGD/R诱导的心肌细胞损伤的保护作用是通过AMPK活化介导的。Westernblot证实GSK621诱导的AMPK活化或AMPKα1-ACC磷酸化，几乎被AMPKα1shRNA或AMPKα1KO完全抑制。在“sh-AMPKα1”及“ko-AMPKα1”细胞，GSK621无法抑制OGD/R诱导的细胞活性降低及细胞凋亡(P=0.002)。 　　5.GSK621激活心肌细胞核因子E2相关因子2(nuclear factor erythroid-2-related factor 2，Nrf2)信号通路并通过其发挥作用。 　　qPCR检测结果表明在心肌细胞，GSK621呈剂量依赖性诱导Nrf2依赖基因的mRNA表达，包括血红素氧合酶1(hemeoxygenase1，HO1)和NADPH醌氧化还原酶(NADPH:quinoneoxidoreductase，NQO1)。尽管Nrf2mRNA水平无明显变化，其蛋白水平显著升高。HO1和NQO1的蛋白水平也显著提高。qPCR结果显示GSK621诱导的心肌细胞中HO1和NQO1的表达完全被AMPKα1沉默或敲除所抑制。携带Nrf2shRNA的慢病毒载体转染心肌细胞后，GSK621诱导的HO1和NQO1表达受抑制，GSK621预处理对OGD/R诱导的细胞活性下降、凋亡增加的抑制作用消失(均P＜0.01)。 　　结论： 　　1.GSK621能够激活心肌细胞中的AMPK信号通路。 　　2.氧糖剥夺/复氧较好地模拟了在体缺血/再灌注对细胞造成的损害，GSK621能够通过抗凋亡、抗氧化等作用对抗OGD/R诱导的心肌细胞损伤。 　　3.AMPK活化介导GSK621诱导的心肌细胞保护作用。 　　4.GSK621可通过激活AMPK进一步活化下游的Nrf2信号通路，并通过AMPK/Nrf2/HO1轴发挥心肌细胞保护作用。