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摘要目的：<br>　　心肌缺血是指心脏的血液灌注减少，可引发心绞痛、心肌梗死、心衰等，严重者甚至可能导致死亡。心肌细胞属于终末细胞系，缺乏再生能力。线粒体作为心肌细胞的主要供能细胞器，在维持心脏收缩方面发挥重要作用，但同时也是活性氧(ROS)的主要来源。减少心肌损伤尤其是线粒体损伤对心肌缺血的防治尤为重要。线粒体自噬是自噬选择性降解受损线粒体的过程，在细胞稳态方面起着重要作用。大量文献报道，植物性雌激素梓醇对心肌细胞具有良好的保护作用，其作用的发挥主要通过雌激素受体介导。前期研究已表明，梓醇与雌激素受体具有较高的结合能力。因此本课题拟观察梓醇对心肌损伤是否有保护作用，这种作用是否通过自噬及线粒体自噬来实现的，并进一步探讨梓醇是否通过上调雌激素受体表达来调节自噬及线粒体自噬的。<br>　　方法：<br>　　1复制糖剥夺诱导的心肌细胞损伤模型，利用酶联免疫吸附(enzyme linked immunosorbent assay，Elisa)、Hochest、免疫印迹染色(Western Blot，WB)、免疫荧光等方法观察梓醇对糖剥夺诱导的H9C2细胞损伤的保护作用。<br>　　2通过单磺酰胺(Dansylcadaverine，MDC)染色、免疫荧光、WB、线粒体染色、透射电镜等方法，围绕线粒体自噬探讨梓醇对心肌损伤保护作用的机制。<br>　　3利用ISO(异丙肾上腺素)复制小鼠急性心肌缺血模型。通过心电图、Elisa、苏木精—伊红染色法(hematoxylin-eosin staining，HE)、马松染色(Masson)、WB及免疫荧光观察梓醇对ISO诱导的小鼠急性心肌缺血损伤的保护作用:进一步通过、阳定量自噬以及线粒体自噬相关亚单位，阐明梓醇对缺血损伤的保护作用与自噬密切相关;慢病毒转染使小鼠ATG5低表达，重复上述实验，进一步确证自噬在梓醇保护机制中的重要作用。通过WB检测梓醇对ISO诱导的小鼠急性心肌缺血损伤中雌激素受体相关亚型ERα与ERβ的表达，比较ATG5正常表达和低表达时ER表达的变化。<br>　　4在心肌细胞上通过ER抑制剂TAM、ERα抑制剂MPP、ERβ抑制剂PHTPP以及进一步利用siRNA技术探讨梓醇在线粒体自噬介导的心肌损伤保护中与ER的关系。<br>　　结果：<br>　　1、梓醇对糖剥夺诱导的H9C2细胞损伤的保护作用<br>　　梓醇对糖剥夺诱导的H9C2细胞损伤的保护效应:糖剥夺后心肌细胞内LDH、丙二醛(Malondialdehyde，MDA)含量增加，超氧化物歧化酶(Superoxide Dismutase，SOD)的活性显著降低，细胞核呈致密浓染，ROS释放增加，线粒体膜电位降低，细胞凋亡相关蛋白BAX及Cleaved-Caspase3显著增加，Bcl-2降低。当给予梓醇干预后，心肌细胞内LDH、MDA含量降低，SOD活性显著增加，细胞核染色较均匀，ROS释放显著减少，线粒体膜电位被逆转，BAX及Cleaved-CaSpase3含量显著降低，Bcl-2含量显著增加。因此梓醇对糖剥夺诱导的H9C2细胞损伤有显著的保护作用。<br>　　2、围绕自噬及线粒体自噬探讨梓醇对糖剥夺诱导的H9C2细胞损伤的保护机制<br>　　(1)梓醇在糖剥夺H9C2细胞损伤模型中对自噬的影响:糖剥夺作用后自噬小体数量未有明显增加，自噬相关蛋白未见明显变化。给予梓醇干预后，自噬小体数量显著增加，自噬特异性蛋白LC3、ATG5及Beclin1含量显著增加，因此梓醇能促进自噬。<br>　　(2)梓醇在糖剥夺H9C2细胞损伤模型中对线粒体自噬的影响:糖剥夺作用后线粒体自噬相关蛋白、线粒体数量未有明显变化。给予梓醇干预后，线粒体自噬特异性蛋白Padkin含量显著增加，PINK1及P62蛋白含量显著降低。因此梓醇能促进线粒体自噬。<br>　　(3)自噬及线粒体自噬抑制后梓醇对糖剥夺诱导的心肌损伤中的作用:给予自噬抑制剂3-MA使自噬被抑制后，细胞核致密浓染显著增加、线粒体膜电位降低、ROS释放增加，细胞凋亡相关蛋白BAX及Cleaved-Caspase3蛋白含量显著增加，Bcl-2蛋白含量显著降低，梓醇对心肌损伤的保护作用明显下降:此外，自噬被抑制后，梓醇对糖剥夺诱导的心肌损伤中LC3及线粒体自噬荧光强度显著降低，对自噬及线粒体白噬相关蛋白的调节作用被逆转，因此自噬及线粒体自噬在梓醇对糖剥夺诱导的心肌损伤中的保护作用必不可少。<br>　　3、siATG5在梓醇对ISO诱导的小鼠急性心肌缺血损伤中的作用及机制的初步探讨<br>　　ATG5在自噬过程中扮演重要角色，其在自噬体形成前期参与形成了自噬共轭体ATG12-ATG5，促进自噬体的膜结构延伸和自噬体的形成。利用慢病毒转染技术使小鼠ATG5低表达后，复制ISO急性心肌缺血模型，观察梓醇对心肌损伤保护作用。<br>　　(1)ATG5干扰后梓醇对ISO诱导的小鼠心肌缺血损伤的影响:ISO诱导后CK及LDH显著增加，BAX及Cleaved-Caspase3的蛋白含量显著升高，Bcl-2含量降低;给予梓醇后，CK及LDH显著降低，BAX及Cleaved-Caspase3的蛋白含量显著降低，Bcl-2含量显著增加。在ATG5干扰的小鼠上给予梓醇后，梓醇对缺血心肌的保护作用被逆转。<br>　　(2)ATG5干扰后梓醇对ISO诱导的小鼠心肌缺血损伤中具体机制的探讨:梓醇能显著增加自噬特异性蛋白LC3、Beclin1、ATG5以及线粒体自噬特异性蛋白Parkin的表达量，显著降低P62及PINK1的蛋白的表达量。在ATG5干扰的小鼠上给予梓醇后，LC3、Beclin1、ATG5以及Parkin的表达量明显降低，P62及PINK1的蛋白的表达量明显增加。ATG5干扰后能抑制梓醇对自噬及线粒体自噬相关蛋白的调节。因此自噬及线粒体自噬在梓醇抑制ISO诱导的小鼠急性心肌缺血损伤中发挥了重要作用。我们同时检测了雌激素受体(ER)的两种亚型ERα及ERβ的蛋白含量。梓醇处理后ERα及ERβ蛋白表达均显著增加，但ATG5干扰后不能抑制梓醇对ER的作用。因此我们在细胞上进一步探讨梓醇在心肌损伤中自噬及线粒体自噬与ER的关系。<br>　　4、ER抑制后梓醇在糖剥夺H9C2细胞损伤模型中对自噬及线粒体白噬的影响<br>　　(1)ER抑制后梓醇在糖剥夺H9C2细胞损伤模型中对细胞损伤的影响:给予ER抑制剂TAM后，细胞核致密浓染显著增加、线粒体膜电位降低、ROS释放增加，细胞凋亡相关蛋白BAX及Cleaved-Caspase3蛋白含量显著增加，Bcl-2蛋白含量显著降低，梓醇对糖剥夺诱导的H9C2损伤的保护作用被抑制。<br>　　(2)ER抑制后梓醇在糖剥夺H9C2细胞损伤模型中对自噬及线粒体自噬的影响:雌激素受体非选择型抑制剂(TAM)以及雌激素受体α选择性抑制剂(MPP)均能明显降低梓醇诱导的LC3荧光强度增加，降低自噬特异性蛋白LC3、Beclin1以及线粒体自噬特异性蛋白Parkin的表达量，明显增加P62及PINK1的蛋白的表达量。但雌激素受体β抑制剂(PHTPP)对自噬的抑制作用较弱。因此，梓醇通过ERα促进自噬及线粒体自噬的表达。我们通过siRNA干扰技术进一步证实了上述结果:ERα低表达能明显降低梓醇诱导的LC3、Beclin1、ATG5以及Parkin的表达量，明显增加P62及PINK1的蛋白的表达量。这些结果表明梓醇是通过ERα促进自噬及线粒体自噬，从而达到保护心肌细胞的作用。<br>　　结论：<br>　　1、梓醇对糖剥夺诱导的心肌损伤具有保护作用，这种保护作用被自噬抑制剂3-MA逆转。<br>　　2、梓醇可明显减轻ISO诱导的小鼠心肌缺血损伤，但当用慢病毒转染使ATG5低表达后梓醇对ISO诱导的小鼠心肌缺血保护作用被逆转，证实梓醇对心肌损伤的保护作用与其诱导的自噬及线粒体自噬密切相关。<br>　　3、在上述基础上用雌激素受体抑制剂TAM干预后，梓醇对心肌损伤的保护作用显著降低。接着选用雌激素受体α抑制剂MPP、雌激素受体β抑制剂PHTPP干预后，发现MPP能有效减弱梓醇对心肌损伤中自噬及线粒体自噬的表达，而PHTPP对自噬及线粒体自噬的影响较小，siRNA干扰技术也证明了这一点。因此，本研究证实梓醇是通过ERα介导的自噬及线粒体自噬减轻缺血引起的心肌细胞损伤。