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摘要前列腺癌(prostate cancer，PCa)是男性最常见的恶性肿瘤之一，有90％的PCa转移都发生在骨组织中。外泌体是细胞释放的一种细胞外囊泡。外泌体携带着蛋白质、脂质和核酸等在细胞间传递信息。许多研究都指出，外泌体能促进癌细胞的侵袭和转移。在PCa骨转移里，外泌体也发挥了巨大的作用。在正常生理情况下，成骨细胞介导的骨形成和破骨细胞介导的骨吸收维持着平衡，使骨组织按人体需要有序地更新改造。但在病理情况下，这种平衡被打破，成骨细胞和破骨细胞的活性都有所改变。有研究认为破骨细胞主导的骨吸收能为PCa侵袭骨组织提供帮助。MiRNAs是大概22个核苷酸长度的非编码小RNA。最近，越来越多的研究展现了miR-214在破骨细胞分化过程中的作用。我们猜想PC-3外泌体是通过改变破骨细胞内的miR-214水平来实现影响的。目前，有关PCa外泌体对破骨细胞影响的研究还比较少，相关的机制还不明确。<br>　　研究目的：<br>　　探究PC-3来源的外泌体对破骨细胞分化的影响，探究miR-214在外泌体干扰破骨细胞分化过程中所发挥的作用，为临床治疗前列腺癌骨转移提供新的思路。<br>　　研究方法：<br>　　1.PC-3外泌体的分离与鉴定<br>　　培养人前列腺癌细胞系PC-3细胞，利用超速离心法分离细胞培养上清液中的外泌体。分离出的外泌体利用透射电镜进行形态观察，粒径分析检测外泌体直径分布和浓度，使用流式细胞术鉴定外泌体表面标记蛋白CD63和CD81。<br>　　2.PC-3外泌体对破骨细胞分化的影响及作用机制<br>　　抽取人外周静脉血，分离单个核细胞，使用M-CSF和RANKL体外诱导破骨细胞。把不同浓度的外泌体与破骨细胞共培养，使用TRAP染色观察破骨细胞的形态，PCR、WB测定miR-214、CTSK、NFATc1和ACP5等基因的表达水平，WB检测NF-κB信号通路激活情况。<br>　　3.miR-214转染对破骨细胞分化的影响及作用机制<br>　　分别在破骨前体细胞中转染miR-214mimic、inhibitor和NC，PCR检测转染后miR-214的表达水平，构建好转染模型后，使用M-CSF和RANKL体外诱导，然后用TRAP染色观察破骨细胞的形态，PCR、WB测定CTSK、NFATc1和ACP5等基因的表达水平，WB检测NF-κB信号通路激活情况。<br>　　研究结果：<br>　　1.PC-3外泌体的分离与鉴定<br>　　电镜下外泌体的直径范围在70-100nm之间，呈中间凹陷的特征性“杯状”结构。所提取PC-3释放的外泌体直径跨度从25nm到295nm，分布最多的在85nm，平均粒径为118.83nm。加入了CD63抗体的外泌体有69.6％为阳性，加入了CD81的外泌体有84.2％表现为阳性。<br>　　2.PC-3外泌体对破骨细胞分化的影响及作用机制<br>　　随着外泌体浓度升高，TRAP染色下成熟的破骨细胞数量减少，破骨细胞miR-214和CTSK、NFATc1、ACP5等基因的表达水平持续下降，NF-κB通路被持续抑制。<br>　　3.miR-214转染对破骨细胞分化的影响及作用机制<br>　　下调miR-214使成熟的破骨细胞数量减少，miR-214和CTSK、NFATc1、ACP5等基因的表达水平持续下降，NF-κB通路被持续抑制。<br>　　研究结论：<br>　　1.采用超速离心法提取PC-3外泌体纯度及浓度均较好，可以用于一系列的体外细胞实验。<br>　　2.PC-3来源的外泌体能抑制破骨细胞分化，降低破骨细胞分化相关基因CTSK、NFATc1、ACP5和miR-214的表达水平，阻断NF-1cB通路的激活。<br>　　3.下调miR-214能抑制破骨细胞的分化，降低破骨细胞分化相关基因CTSK、NFATc1和ACP5的表达水平，阻断NF-KB通路的激活。