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摘要细胞自噬是在酵母乃至哺乳动物中普遍发生并受到严格调控的重要生理过程，它的功能是负责清除和降解受损细胞器、细胞内的错误折叠蛋白还有外来病原物等。细胞自噬异常与神经退行性疾病等许多人类疾病密切相关。尽管细胞自噬在酵母和哺乳动物中研究得比较多，但在不同进化地位的物种中细胞自噬的功能和调控机制存在显著差异。<br>　　从酵母至哺乳动物中，细胞自噬相关(ATG)蛋白ULK1/ATG1-ATG13被证实是最为重要的复合体，负责细胞自噬的起始，但该复合体起始自噬的方式在酵母-果蝇-哺乳动物中存在差异。与酵母和哺乳动物均不相同，在果蝇中单独超表达Atg1就能够诱导细胞自噬，而单独超表达Atg13却抑制细胞自噬，同时超表达Atg1/Atg13能够在更大程度上促进自噬。果蝇的ATG1蛋白在细胞自噬发生时去磷酸化，而ATG13蛋白则发生磷酸化修饰，但是目前果蝇以外的其它昆虫物种中尚未研究报道ATG1/ATG13蛋白复合体的磷酸化修饰方式。家蚕是重要的经济昆虫，也是鳞翅目昆虫的代表。实验室在前期的研究工作中发现，家蚕Atg1不仅参与细胞自噬而且还具有其他重要的生理功能，如Atg1RNAi后家蚕脂肪体内的细胞自噬水平显著下调，脂代谢受阻等。因此，本论文深入研究了家蚕中ATG1蛋白的磷酸化修饰方式及其对ATG1功能的调控，本文研究主要获得以下结果:<br>　　1.保守结构域比对和进化分析显示，除了BmATG1a、BmATG1b外，家蚕中还存在第三个Atg1的剪切体BmATG1c。它们的N-端都含有PKC结构域，并且在进化上与脊椎动物和无脊椎动物的PKC结构域保守。家蚕脂肪体中BmAtg1基因的3个剪切体BmAtg1a/b/c的表达模式与血淋巴中的20E-羟基蜕皮酮（20-hydroxyecdysone，20E）含量变化趋势较吻合，尤其是BmATG1c蛋白在20E高滴度的预蛹时期达到最高值。<br>　　2.BmAtg1为家蚕细胞自噬所必需。游走前12小时的家蚕注射BmAtg1基因的dsRNA24小时后，BmATG1的蛋白水平显著下调，而ATG8和P62蛋白增多，说明细胞自噬受阻。在家蚕BmN细胞中超表达BmAtg1后，ATG8和P62蛋白减少，显示自噬增强;同时，BmAtg1超表达能够引起ATG8蛋白在细胞质中聚集形成小亮点;并且，BmAtg1超表达能够增强饥饿诱导的细胞自噬。上述结果显示，BmAtg1可以直接诱导并增强上游信号诱导家蚕中细胞自噬的发生。<br>　　3.家蚕BmATG1蛋白在细胞自噬时发生磷酸化修饰。BmATG1蛋白的发育变化暗示了它们在细胞自噬时可能发生磷酸化修饰，进一步用饥饿和20E处理5L3D家蚕幼虫诱导细胞自噬后，以家蚕BmATG1c为代表，研究发现BmATG1蛋白的条带发生上移，再进行λ-磷酸酶去磷酸化处理后，BmATG1c条带则又迁移回原来的位置，暗示其由磷酸化形式转变成非磷酸化形式。如上所述，20E和饥饿可能阻断胰岛素，营养和能量信号以诱导BmATG1磷酸化，wortmannin和LY294002是阻断胰岛素信号传导的PI3K特异性抑制剂，metformin是AMPK特异性激活剂，rapamycin是TORC1特异性抑制剂，将这些化合物分别注入SL3D幼虫中，收集脂肪体，在处理后24小时进行Western blotting分析。每种化合物均显著上调BmATG1c的蛋白水平，wortmannin和LY294002具有更强的作用，而λ-磷酸酶处理降低了BmATG1c上面的条带。上述研究结果表明BmAtg1c mRNA，蛋白质和磷酸化水平是由20E和饥饿诱导的，但在转录和磷酸化水平下被胰岛素，营养和能量信号降低。<br>　　4.家蚕BmATG1c蛋白中存在2个昆虫保守的磷酸化位点，并且这两个位点为其细胞自噬功能所必需。哺乳动物动物同源蛋白ULK1中的TORC1和AMPK磷酸化位点在BmATG1不存在，因此利用免疫沉淀和蛋白质谱在BmATG1c上鉴定到两个昆虫特异的磷酸化位点S269和S270。在家蚕BmN细胞中超表达BmAtg1c基因促进BmATG1和BmATG8蛋白的共定位，诱导细胞自噬的发生，并且增强饥饿条件诱导的自噬。进一步超表达BmATG1的磷酸化位点双突变形式BmATG1-S269A/270A以及单点突变的BmATG1-S269A或BmATG1-S270A都能阻断BmATG8自噬点的形成，削弱饥饿诱导的自噬。此外，BmAtg1c过表达能够诱导果蝇脂肪体中细胞自噬的发生，而它的磷酸化位点突变则抑制了BmAtg1c在果蝇脂肪体中诱导细胞自噬的功能。<br>　　综上所述，家蚕BmATG1蛋白在细胞自噬发生时被磷酸化修饰，BmATG1蛋白存在两个昆虫特异的磷酸化位点。以BmATG1c为例，其超表达能够直接诱导家蚕和果蝇中细胞自噬的发生，并且它的磷酸化位点为其自噬功能所必需。