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摘要1947年在乌干达的寨卡丛林中，科学家们首次在恒河猴中发现并分离寨卡病毒。在此后的60年间里，由于寨卡病毒感染病例较少，感染寨卡病毒之后病人不表现严重症状，所以它一直没有受到重视。直至2007年，在西太平洋的雅浦岛上，寨卡病毒首次在人群中大规模暴发，超过80％的当地居民被感染。更重要的是，此后当地居民患格林巴列综合征的发病率显著提高。在2015年，寨卡病毒又在世界范围内发生了大暴发，超过80个国家及地区发现寨卡病毒病例。在全球范围内，超过200万例病人表现出寨卡病毒感染后的症候群。其中，仅在巴西，就有超过100万例被感染的病人。在此大暴发过程中，科学家们发现寨卡病毒感染可以致使婴儿或胎儿罹患小头症。这些因素导致在2016年，世界卫生组织WHO将寨卡病毒大暴发列为“全球性紧急突发事件”，从而引起世界所有国家及地区的重视。与此同时，各国科学家也积极参与对寨卡病毒基础及临床相关研究。基于此背景下，我将自己的课题聚焦于研制开发寨卡病毒疫苗及探究在寨卡病毒疫苗如何诱导保护性免疫反应。<br>　　首先，我设计了一个重组亚单位疫苗免疫原并且使用它建立实验系统。寨卡病毒隶属于黄病毒科、黄病毒属。寨卡病毒的基因组是包括一个整体开放阅读框(Open Reading Frame，ORF)的单链正义RNA，其编码3个结构蛋白及7个非结构蛋白。完全成熟的寨卡病毒颗粒表面是由90对反向平行的包膜蛋白(E)组成的正20面体。因为E蛋白的外包膜区域(E80)是中和抗体的主要结合位点，所以直接选取了E80蛋白作为免疫原。利用真核果蝇表达系统(S2expression system)和原核大肠杆菌表达系统(E.coli expression system)分别表达并纯化了寨卡病毒E80蛋白，并分别命名为E80_S和E80_E。<br>　　为了检测这两种免疫原的免疫原性，分别将E80_S蛋白和E80_E蛋白与铝佐剂混合，在第0周，第2周和第4周对野生型Balb/c小鼠进行了三次免疫，用PBS与铝佐剂混合并免疫的Balb/c小鼠作为阴性对照组。在第5周，解剖小鼠获得脾脏，通过滤网研磨过滤获得脾脏细胞，以用于细胞免疫反应检测。在ELISPOT实验中，与PBS免疫的阴性对照组相比，蛋白免疫组小鼠的脾脏免疫细胞只有在寨卡病毒E80蛋白刺激后，IFNγ的分泌量显著上升;而免疫组中对照蛋白(不相关HIV合成多肽及相似蛋白登革病毒E80蛋白)刺激后的脾脏细胞，无显著IFNγ分泌量增加。与ELISPOT结果相类似，通过流式细胞分析(FACS)，只有在寨卡病毒E80蛋白作为刺激物时，免疫组的CD4T细胞中IL-2才会显著表达。这说明两种免疫原都可以有效地引起免疫正常小鼠体内的抗原特异性细胞免疫反应。在平行实验中，第6周，采取小鼠血清，检测抗体反应。通过免疫酶联反应(ELISA)实验检测，两种免疫原在低免疫剂量(10μg)及高免疫剂量(50μg)免疫小鼠中均可以诱导出抗原特异性抗体反应。在各组小鼠抗原特异性抗体量的比较中，高剂量组显著优于低剂量组，同时E80S免疫组显著优于E80E免疫组。之后，进一步检测了血清中和抗体反应，发现两种免疫原均可以在免疫正常小鼠中诱导产生中和抗体反应。其中高剂量E80S免疫组小鼠体内中和抗体水平最高。最后，在野生型小鼠模型中，检测了免疫后的小鼠对寨卡病毒感染的抵抗能力。使用高剂量E80E和E80S免疫的小鼠，病毒血症严重程度和病毒血症持续时间均显著低于阴性对照组中的小鼠。部分(2/5)高剂量E80_S免疫的小鼠完全没有产生病毒血症。此外，高剂量E80_S和E80_E免疫的小鼠在寨卡病毒感染时，体重下降程度显著小于阴性对照组。这说明E80_S和E80_E免疫原可以有效地诱导正常小鼠产生细胞免疫和体液免疫应答，并在寨卡病毒感染时，为免疫小鼠提供有效的保护作用。<br>　　随后，我使用了更复杂的病毒形式的免疫原来探究其是否也可以诱导出保护性免疫反应。由于寨卡病毒无法阻断小鼠中I型干扰素通路(IFNα/β通路)，所以寨卡病毒不能在免疫健全小鼠中复制。在正常小鼠中，寨卡病毒可以认为是体内减毒活疫苗。通过anti一IFNRα/β抗体免疫调节之后，寨卡体内减活病毒疫苗可以在免疫后第七天就快速诱导出高中和力的抗体。在第七天的中和抗体中，已经存在大量抗原特异性IgG。而在所有IgG中，IgG2a(c)占比例较大。滤泡辅助性T细胞(Tfh细胞)和生发中心B细胞(GC B细胞)对于抗体产生有至关重要的作用。于是在免疫正常小鼠中，具体的描述了从免疫后第7天到第28天的Tm细胞、前体滤泡辅助性T细胞(pre-Tfh细胞)和GC B细胞反应的反应动力学。并且，发现Tfh细胞和GC B细胞反应与中和抗体反应密切相关。<br>　　因为之前有文献报道，流感疫苗免疫后，Th1细胞而不是Tfh细胞对于保护性中和抗体反应和IgG2抗体型转换过程至关重要。所以希望验证这个结论是否也适用于寨卡病毒。于是，使用了Bcl6a/nCd4-Cre小鼠，相比于野生型小鼠，Bcl6/fl/fl Cd4-Cre小鼠中Th1细胞反应是正常的，而Tfh细胞和pre-Tfh反应几乎完全缺失。通过检测抗原特异性抗体反应，发现Bcl6fl/flCd4-Cre小鼠体内产生的各种抗原特异性IgG亚型抗体量均少于野生型小鼠;并且其体内IgGl+，IgG2b+，IgG2c+B细胞显著减少，但IgM+B细胞显著上升。这说明Tfh细胞的缺失导致了小鼠体内抗体型转换被阻断。此外，相比于正常小鼠，Bcl6fl/fl Cd4-Cre小鼠在免疫后中和抗体水平显著下降，并且随着时间的推移，两组小鼠血清中的中和抗体量差距也进一步的扩大。这说明Tfh细胞不仅对于中和抗体的产生不可或缺，并且在长效中和抗体的形成过程中也起到了重要的作用。总结上述结果，Tfh细胞而不是Th1细胞对寨卡疫苗免疫过程中诱导产生的长效保护性中和抗体反应的产生起到了至关重要的作用。<br>　　更有趣的是，在anti-IFNRα/β抗体免疫调节后，经过寨卡体内减毒活疫苗免疫，大约有2/3的Tfh细胞分泌Th1细胞典型分泌的细胞因子IFNy。并且，这些IFNγ+Tfh细胞几乎都表达Tfh功能性细胞因子IL21，说明这些IFNγ+Tfh细胞是具有功能的Tfh细胞。通过蛋白水平和基因水平上的分析，发现这群IFNγ+Tfh细胞仍然高表达Tfh细胞特异性分子，例如Bcl6，ICOS，CD40L等。此外，这群IFNγ+Tfh细胞会同时表达Th1细胞的特异性分子，例如CXCR3，T-bet，EOMES等。由于其既符合传统Tfh细胞特征又具有Th1细胞特征，将这群细胞称之为Th1-like Tfh细胞。Th1-1ike Tfh细胞虽然具有传统Tfh细胞和Th1细胞特征，但其基因表达谱又不同于这两种细胞，是一种新型的Tfh细胞亚型。这群Th1-like Tfh细胞的产生依赖于T-bet基因的表达。在T-bet-/-小鼠中，Th1-1ike Tfh细胞大幅度减少。通过T-bet-/-小鼠模型，发现Th1-like Tfh细胞的缺失会阻断IgG2a(c)抗体型转换。并且在IFNγR-/-小鼠中，也发现了相似的现象。这就说明Th1-like Tfh细胞可能通过IFNγ对IgG2a(c)抗体型转换起到了作用。<br>　　综上所述，本论文探究了重组亚单位疫苗和减毒疫苗两种不同形式的寨卡病毒疫苗所诱导的保护性免疫反应。发现了Tfh细胞反应，尤其是Th1-like Tfh细胞反应对于诱导长效保护性中和抗体反应和抗体型转换发挥至关重要作用。该研究的重要性可以总结为以下两点:1)证明了开发寨卡病毒重组亚单位疫苗和减毒活疫苗两种不同形式的疫苗的可行性:2)发现了一类新型Th1-like Tfh细胞，提示在进一步改进寨卡病毒疫苗过程中，需要考虑调控Th1-1ike Tfh细胞反应。