检索历史 清除

摘要肠出血性大肠杆菌(Enterohemorrhage E.Coli,EHEC)是一种重要的食源性人兽共患性致病菌，可引起人腹泻，血栓性血小板减少性紫癜、出血性结肠炎及溶血性尿毒症等严重并发症，死亡率较高。肠出血性大肠杆菌的外膜蛋白、粘附素以及外毒素无论在其致病还是抵御宿主免疫杀伤方面都扮演着重要的角色。本研究所用的O157:H7菌株是肠出血性大肠杆菌中主要的致病菌株，是从有腹泻症状牛的粪便中分离出来的菌株。尽管大肠杆菌的致病机理已经被广泛研究，但随着生物研究技术的不断进步，人们逐步发现了更多潜在致病的毒力因子。<br>　　本研究中，我们通过生物信息学分析，找到肠出血性大肠杆菌中独有的新的双组份调节系统。通过进一步分析，我们发现该双组份调节系统很有可能感应某种六碳糖的存在而引起一系列的基因调控的发生，是一种感应环境变化的信号转导系统。本研究首次发现，该双组份调节系统中的反应调控蛋白可以引起双组份调节系统所在的毒力岛内基因转录水平的上升，并且在甘露糖存在的情况下，双组份调节系统所在的毒力岛基因转录水平也均有上调现象发生。<br>　　利用RED同源重组技术构建了O157:H7的反应调控蛋白g5428基因的缺失株，并利用高拷贝质粒pMal-c2x构建了反应调控蛋白的超量表达株，同时将pMal-c2x质粒导入g5428基因的缺失株中构建了对照菌株，通过对比野生株、超量表达株与对照株在富营养或基本培养基培养基中的生长状况，分析双组份的反应调控蛋白是否会影响该致病菌体外培养条件下的生长。结果表明，在体外培养的富营养培养基中，反应调控蛋白的高表达或缺失并不会影响细菌的生长繁殖。<br>　　通过在双组份调节系统所在的毒力岛相连基因间设计引物，以cDNA为模板的PCR试验我们发现，在双组份调节系统所在的毒力岛中，除了反应调控蛋白基因与组氨酸激酶基因外，其他的基因很有可能在转录时形成一个共同的信使RNA，我们利用5'RACE试验找到毒力岛基因共转录的起始位点。通过纯化反应调控蛋白进行EMSA试验，我们验证了反应调控蛋白可以在体外结合毒力岛的转录起始部位，进而提高毒力岛的转录水平。我们通过footprint试验找到了反应调控蛋白的核酸结合位点。通过以上分子生物学试验我们了解到双组份系统中反应调控蛋白作用结合位点以及调控的部分基因，为以后研究该双组份系统在细菌中调控作用打下基础。据我们所知，这是关于该新的双组份调节系统调控作用的首次报道。