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摘要鉴于以上理论，本课题以失分化型甲状腺癌WRO82-1及dFTC-133细胞为研究对象，研究奈韦拉平对细胞增殖、侵袭转移及摄碘能力的影响及其机制，并以WRO82-1细胞构建裸鼠种植瘤模型，在裸鼠体内进一步验证奈韦拉平对侵袭转移及摄碘能力的作用。本研究旨在探讨奈韦拉平在治疗失分化型甲状腺癌中的作用及其机制，为临床患者的治疗提供新的思路与依据。<br>　　第一部分 奈韦拉平对失分化型甲状腺癌摄碘能力的影响及机制探讨<br>　　研究目的：<br>　　1.观察奈韦拉平对失分化型甲状腺癌细胞摄碘能力的影响。<br>　　2.明确奈韦拉平调控失分化型甲状腺癌细胞摄碘能力的机制。<br>　　3.动物实验进一步验证奈韦拉平对失分化型甲状腺癌摄碘能力的影响。<br>　　研究方法：<br>　　1.人失分化型甲状腺癌WRO82-1细胞及人滤泡状甲状腺癌FTC-133细胞培养。<br>　　2.构建失分化滤泡状甲状腺癌dFTC-133细胞株。<br>　　通过131碘照射FTC-133构建失分化型甲状腺癌dFTC-133细胞株。用15μCi131碘照射FTC-133细胞3天，然后在基础培养基中培养3个月，挑选单克隆细胞继续培养。摄碘率最低的克隆细胞群被定义为dFTC-133细胞，与碘转运相关的基因NIS、TSHR及TPO表达均明显减少。<br>　　3.运用细胞计数试剂盒-8(CCK-8)检测奈韦拉平对WRO82-1及dFTC-133细胞增殖的影响。<br>　　将不同浓度的奈韦拉平（100、200、350和500μM）加入WRO82-1及dFTC-133细胞中，在不同时间点(24、48及72小时)采用CCK-8实验检测细胞的增殖情况。<br>　　4.运用流失细胞学技术检测奈韦拉平对WRO82-1及dFTC-133细胞凋亡的影响。<br>　　运用不同浓度的奈韦拉平（100、200、350和500μM）分别处理WRO82-1及dFTC-133细胞24、48及72小时，采用Annexin V-FITC凋亡检测试剂盒在流式细胞仪检测不同浓度不同时间点时细胞的凋亡情况。<br>　　研究结果：<br>　　1.低剂量奈韦拉平显著抑制两种细胞增殖，抑制作用呈浓度和时间依赖性，但并不明显促进细胞凋亡。<br>　　低浓度奈韦拉平（100μM和200μM）处理细胞72小时并未见细胞明显凋亡（均P＞0.05），但细胞抑制率明显增加。200μM奈韦拉平处理细胞72小时后，WRO82-1及dFTC-133细胞生存率分别为74.9±3.1％ and77.4±2.8％（均P＜0.05）。<br>　　2.奈韦拉平显著增加甲状腺分化相关基因TSHR、NIS及甲状腺转录因子PAX8表达。<br>　　qRT-PCR结果显示，奈韦拉平明显增加PAX8、TSHR及NIS mRNA表达水平，TPO、TTF-1和TTF-2 mRNA水平未见增加。200μM奈韦拉平处理WRO82-1及dFTC-133细胞72小时后，与阴性对照组相比，TSHR mRNA分别增加3.7倍和3.0倍，PAX8 mRNA分别增加2.9倍和2.8倍，NIS mRNA分别增加1.9倍和1.8倍(均P＜0.05)。<br>　　3.奈韦拉平增加失分化型甲状腺癌NIS蛋白的膜定位。<br>　　Western blot实验发现NIS蛋白在胞膜中的表达水平明显增加，且呈浓度依赖性和时间依赖性。200μM奈韦拉平处理72小时后，较阴性对照组，NIS蛋白的胞膜/胞浆比值分别增加1.8倍和1.9倍;较奈韦拉平处理24小时组，NIS蛋白的胞膜/胞浆比值分别增加1.3倍和1.6倍（均P＜0.05）。免疫荧光共聚焦实验进一步证实，较胞浆NIS表达水平，奈韦拉平增加细胞膜上NIS表达水平更显著。<br>　　4.奈韦拉平增加失分化型甲状腺癌细胞摄碘率。<br>　　体外细胞摄碘率实验表明，奈韦拉平呈时间和浓度双依赖性增加细胞摄碘率。200μM奈韦拉平处理72小时后，WRO82-1和dFTC-133细胞摄碘率较阴性对照组分别增加1.7倍和2.1倍;200μM奈韦拉平处理24、48和72小时后，WRO82-1摄碘率分别增加1.3倍、1.4倍和1.8倍，dFTC-133细胞摄碘率分别增加1.3倍、1.6倍和2.1倍（均P＜0.05）。<br>　　5.奈韦拉平显著增加PAX8蛋白表达水平，而PAX8是介导奈韦拉平调控NIS表达及摄碘能力的关键因素。<br>　　Western blot结果表明，200μM奈韦拉平处理WRO82-1和dFTC-133细胞72小时，PAX8蛋白表达水平较阴性对照组分别增加2.7倍和2.2倍（均P＜0.05）。运用慢病毒敲低PAX8蛋白水平后，NIS蛋白表达及细胞摄碘率明显下调（均P＜0.05）。这些结果表明PAX8与NIS蛋白表达上调、细胞摄碘率增加有关，而且是介导奈韦拉平调控NIS表达及摄碘能力的关键因素。<br>　　6.奈韦拉平能够激活TSHR/cAMP/CREB/PAX8通路，从而上调细胞摄碘率。<br>　　Western blot结果表明，奈韦拉平明显增加甲状腺激素受体(TSHR)、环磷酸腺苷(cAMP)及环磷腺苷效应元件结合蛋白（CREB）磷酸化水平（均P＜0.05），给予cAMP抑制剂SQ22536处理后，上调表达的TSHR、cAMP及pCREB(Ser133)蛋白被抑制，NIS蛋白表达及细胞摄碘率也被抑制（均P＞0.05），提示奈韦拉平增加NIS蛋白表达及细胞摄碘率的作用是激活TSHR/cAMP/CREB/PAX8通路实现的。<br>　　研究结论：<br>　　1.奈韦拉平能显著抑制失分化型甲状腺癌WRO82-1及dFTC-133细胞增殖。<br>　　2.奈韦拉平显著提高细胞摄碘率，其机制是通过激活TSHR/cAMP/CREB/PAX8通路上调NIS蛋白表达，并促进NIS蛋白的膜定位。<br>　　3.奈韦拉平显著抑制失分化型甲状腺癌裸鼠移植瘤生长;并显著上调裸鼠移植瘤NIS蛋白表达及肿瘤的摄碘能力。<br>　　第二部分 奈韦拉平对失分化型甲状腺癌侵袭转移的影响<br>　　研究目的：<br>　　1.动物实验检测奈韦拉平对失分化型甲状腺癌侵袭转移的影响。<br>　　2.观察奈韦拉平对失分化型甲状腺癌细胞侵袭转移的影响。<br>　　3.探索奈韦拉平调控失分化型甲状腺癌细胞侵袭转移的可能机制。<br>　　研究方法：<br>　　1.构建失分化型甲状腺癌裸鼠皮下移植瘤模型。<br>　　2.苏木精-伊红(HE)染色检测甲状腺癌细胞远处转移。<br>　　组织用4％多聚甲醛固定24小时，脱水、石蜡包埋，切成4μm薄片，经脱蜡再水化后，用苏木精和伊红染色，显微镜下观察细胞形态。<br>　　3.培养失分化型甲状腺癌WRO82-1细胞。<br>　　4.Tranwell小室迁移/侵袭实验检测奈韦拉平对细胞迁移、侵袭的影响。<br>　　200μM奈韦拉平处理细胞72小时，采用Tranwell小室迁移/侵袭实验观察奈韦拉平对细胞迁移、侵袭功能的影响。<br>　　5.qRT-RCR及western blot实验检测VEGFA、MMP2及MMP9表达。<br>　　为观察奈韦拉平对侵袭相关指标的影响，用200μM奈韦拉平处理细胞72小时，qRT-RCR及western blot实验从mRNA及蛋白水平分别检测VEGFA、MMP2及MMP9表达水平。<br>　　研究结果：<br>　　1.动物实验表明奈韦拉平显著抑制失分化型甲状腺癌肝转移。<br>　　HE染色结果显示，裸鼠移植瘤发生肝转移，奈韦拉平灌胃处理组转移明显减少，阴性对照组肝脏可见更多转移灶，表现为梭形细胞、非典型巨大细胞伴随病理性有丝分裂。<br>　　2.奈韦拉平显著抑制失分化型甲状腺癌细胞侵袭转移及相关基因VEGFA、MMP2及MMP9表达。<br>　　Tranwell小室迁移/侵袭实验显示，200μM奈韦拉平处理72小时后，细胞迁移、侵袭功能均被明显抑制，迁移率减少至34.38±2.35％，侵袭率下调至31.47±2.76％（均P＜0.05）。qRT-RCR及western blot实验显示，奈韦拉平明显抑制VEGFA、MMP2及MMP9 mRNA及蛋白表达水平（均P＜0.05）。<br>　　3.奈韦拉平抑制细胞侵袭转移可能与抑制IL-6/JAK2/STAT3通路有关。<br>　　qRT-RCR实验显示，奈韦拉平明显抑制IL-6 mRNA水平(P＜0.05)，westernblot实验显示奈韦拉平明显抑制pJAK2(Y1007+Y1008)及pSTAT3(Tyr705)蛋白磷酸化水平（均P＜0.05）。200μM奈韦拉平处理72小时后，pJAK2(Y1007+Y1008)及pSTAT3(Tyr705)蛋白磷酸化水平分别减少56.0％和46.1％。提示奈韦拉平抑制失分化型甲状腺癌细胞侵袭转移可能与IL-6/JAK2/STAT3通路有关。<br>　　研究结论：<br>　　1.体内外实验均显示:奈韦拉平显著抑制失分化型甲状腺癌肝转移。<br>　　2.细胞实验显示:奈韦拉平显著抑制失分化型甲状腺癌WRO82-1细胞侵袭转移，该作用可能是通过抑制IL-6/JAK2/STAT3通路实现的。