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摘要CRISPR-Cas系统是一类广泛存在于细菌和古细菌中的免疫防御系统。一套有效的CRISPR-Cas系统主要由成簇的规律间隔短回文重复序列(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats，CRISPR)以及CRISPR相关蛋白(CRISPR-associated proteins，Casproteins)基因构成。它利用CRISPR序列转录产生的非编码RNA(CRISPR RNA，crRNA)对外源DNA的序列特异性识别，通过Cas蛋白复合体对入侵的外源基因的切割来抵御病毒或噬菌体的入侵。由于CRISPR-Cas系统具有极高的精准度，通过适当优化即可能成为高效的分子生物学工具，目前在基因编辑、生物成像、疾病诊断等方面中均有所应用。根据Cas效应元件的类型不同，CRISPR-Cas系统可被分为Class1和Class2两大类，其中Class2中TypeⅡ(Cas9)已经成为广泛应用的第三代基因编辑工具，然而该系统仍存在核酸酶分子量过大，体内编辑效率较低，以及明显脱靶效应等缺陷。因此深入研究CRISPR-Cas9系统作用机制，发现并筛选新型具有更高效率Cas9效应蛋白，设计优化酶切特异性，开发新型CRISPR基因编辑工具具有重要意义。本论文工作深入研究了CRISPR-Cas9系统中Cas9-sgRNA复合物对靶DNA识别的分子动力学和R-loop结构的形成过程，并以此为基础对Cas9蛋白的HNH结构域进行多种突变及改造，筛选具有高活性及高特异性的Cas9突变体，同时对Cas9蛋白进行工程化改造，开发了两种可调控活性的Cas9蛋白嵌合体。<br>　　本论文主要包括以下内容:<br>　　详细阐述了CRISPR-Cas系统的发现发展、作用机制、系统分类以及应用，介绍了CRISPR-Cas9系统的基本情况，总结了目前针对Cas9蛋白酶切特异性优化改造方法。讨论了目前研究中需要解决的关键问题，以此提出本论文的研究内容。<br>　　表征了Cas9-sgRNA对靶DNA识别及切割过程中R-loop复合体形成的动力学过程，探究了CRISPR-Cas9基因编辑系统的分子作用机制。我们发现，在Cas9-sgRNA复合物对靶DNA识别过程中可将其分为PAM、Linker、Seed、Middle和Tail区域并发挥不同功能。其中PAM区域是Cas9-sgRNA复合物识别靶DNA过程中不可或缺的元件;Linker区域的长度影响酶切活性和Non-target链的酶切特异性;Seed区域与sgRNA的匹配是有效酶切所必需的，该区域sgRNA由Cas9蛋白上富含精氨酸的桥接螺旋固定并参与R-loop的起始;Middle区域匹配增强R-loop稳定性，Cas9由“部分活性”转变为“完全活性”构象实现双链有效切割;Tail区域的错配能够增加酶切活性。单分子荧光共振能量转移实验中发现R-loop复合体的形成存在中间状态，其热力学稳定性与sgRNA和DNA碱基匹配长度相关，当R-loop形成至临界尺寸，HNH结构域有足够的空间转化为活性构象并完成对靶DNA的切割。R-loop的尺寸是18bp时，中间状态最为稳定，Cas9活性最强。本章的工作对CRISPR-Cas9系统R-loop形成过程中的分子细节提供了新的见解，揭示了SpyCas9系统脱靶问题的部分原因，为深入研究CRISPR-Cas9作用机制和酶切特异性优化提供了新思路。<br>　　基于Cas9系统中HNH结构域对于实现酶切的重要性。根据对R-loop形成过程以及HNH结构域构象变化的理解，对Cas9蛋白HNH结构域上与目标链相近一侧的带电氨基酸残基设计了26种单点突变体，筛选出具有高特异性的R780A、K810A、D837A、N863D和K866A突变体，其中R780A、K810A和N863D突变体同时具有高酶切活性，并对D837A、K866A突变体进行活性优化。另外尝试对Cas9活性状态时HNH空间邻近带电氨基酸残基进行突变、HNH两端Linkers区域进行突变以及HNH的整体替换的方法进行改造。在本章的工作中，通过Cas9蛋白HNH结构域的优化改造，得到酶切特异性较高的突变体，同时也印证了HNH结构域在Cas9酶切过程中起到重要作用，为Cas9蛋白的特异性优化提供了新的手段。<br>　　通过在Cas9蛋白非活性状态下HNH结构域与RuvC结构域之间合理地引入二硫键或在HNH和RuvC结构域之间的引入锌指结构域，开发了两种可诱导调控的Cas9蛋白，通过感应特定的外部刺激实现酶切活性的调控。通过氧化还原环境来调控酶切活性的RedoxCas9，其活性可由Cu2+、DTT、G-S-S-G/G-SH等条件调控。另外设计通过锌离子浓度调节酶切活性的ZfCas9，通过Zn2+浓度控制HNH结构域构象的变化从而实现酶切活性的控制。在本章的工作中开发了新型可调控的Cas9工程化蛋白，进一步证明HNH结构域在酶切过程中构象的变化。<br>　　综上所述，本论文对CRISPR-Cas9的分子机制进行了较为深入的研究，并进一步筛选新型高活性高特异性的Cas9蛋白突变体，同时构建能够感应特定外界刺激的Cas9改造蛋白并探索其应用，为CRISPR-Cas9的研究提供了新的思路。