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摘要结核病仍是世界上最严重的疾病之一，世界卫生组织报道称每年仍有1000万人感染结核杆菌，200万人死于结核病。异烟肼(INH)具有特异性强、副作用小及价格低等特点，是最常用的一线抗结核药物。然而其确切的分子作用机理目前仍然不十分清楚。本论文主要研究了异烟肼及其他肼类和酰肼类物质被金属离子特别是锰和铜离子催化氧化的自由基机理。研究内容主要包括以下部分:首次捕获催化氧化异烟肼过程中生成的氮中心自由基并确定其准确位点<br>　　作为最常用的抗结核药物之一，INH可能的作用机理被认为是通过过氧化物酶KatG催化氧化产生的酰碳自由基与NAD+结合，从而抑制结核杆菌细胞壁的生成。但是INH被氧化的具体过程仍不清楚。有趣的是，有研究表明INH被某些KatG酶催化氧化的过程需要Mn的存在。然而，作为酰碳自由基的前体，氮中心自由基能否生成仍未可知;如果生成，其准确位置在肼基的前端还是末端？为了回答以上问题，本研究综合采用ESR自旋捕获和HPLC/MS方法，检测并确认了INH可被醋酸锰(Mn(OAc)3)催化氧化产生氮中心自由基。采用15N同位素标记法进一步确定了氮自由基的准确位置位于肼基的末端氮原子。此外还检测到一种新的反应产物，1，2-二异烟酰基肼。在其他的酰肼类物质反应体系中也得到类似的结果。本研究是首次捕获到INH催化氧化过程中产生的氮自由基并确认其准确位置。该发现对研究INH被催化氧化的分子机理，发现更有效的抗结核药物提供了新视角，具有广泛的生理和毒理学意义。<br>　　综合采用ESR自旋捕获和HPLC/MS法准确鉴定抗结核药物异烟肼及其结构类似物氧化产生的关键酰碳自由基活性中间体<br>　　先前研究表明INH可能的作用机理是它可被过氧化物酶KatG催化氧化产生的酰碳自由基(INH-CO·)与NAD+结合，从而抑制结核杆菌细胞壁的生成，在这个过程中酰碳自由基发挥重要作用。在本研究中，选用DMPO（5，5-二甲基-1-吡咯啉-N-氧化物）为捕获剂，Cu(Ⅱ)为氧化剂，用ESR自旋捕获技术，我们可检测到DMPO与INH的酰碳自由基加合物DMPO/INH-CO·的ESR信号，但该加合物却不能用HPLC/MS方法检测和鉴定。选用PBN（N-叔丁基-α-苯基硝酮）为捕获剂，不仅可用ESR自旋捕获检测到PBN/INH-CO·的ESR信号，而且同时也能用HPLC/MS方法检测并鉴定该加合物。我们进而发现INH的另外四种结构类似物（烟酸酰肼、2-吡啶甲酰肼、2-Cl异烟肼和苯酰肼）均可产生相应的酰碳自由基。烟酸酰肼和苯酰肼可被氧化形成其相应的酰碳自由基，并可与NAD+形成加合物，但是研究报道NH和BH的最低抑菌浓度(MIC)高于INH，可降低INH的抗菌活性，不能用于结核病的治疗;而2-吡啶甲酰肼不易被Cu(Ⅱ)氧化形成其相应的酰碳自由基，只有选用MnO2作为氧化剂时才会被很好的检测到，这可能是由于形成了一个氧化还原活性较低的Cu(Ⅱ)/2-NH络合物。而Cl-INH不能检测到C中心的酰碳自由基与NAD+生成的加合物，这可能是由于氯基吸电子的影响。这是首次综合采用ESR自旋捕获和HPLC/MS法准确鉴定抗结核药物异烟肼及其结构类似物氧化产生的关键酰碳自由基活性中间体。该发现对研究酰肼类物质被氧化的分子机理有重要意义，且对未来发现更有效性的抗结核药物提供了新视角，具有广泛的生理和毒理学意义。<br>　　锰催化氧化异烟肼过程中发现一类依赖于O2·-而非H2O2的HO·的生成机制<br>　　先前研究发现肼类化合物可被Mn(Ⅲ)激活，生成活性最强的HO·。然而，无论是潜在的HO·生成的确切的分子机制，还是结构-活性关系，都没有被清楚地了解。在这里，我们证明了所有的肼和酰肼类化合物（包括INH）与Mn(Ⅲ)确实可以生成HO·，其中肼被发现是最强的。有趣的是，我们发现肼/Mn(Ⅲ)生成·OH不仅依赖于超氧阴离子自由基(O2·-)的生成，而且与O2·-的生成有很好的相关性，但与H2O2无关。进一步的研究表明，Mn(Ⅱ)和O2·-都可在Mn(Ⅲ)/肼氧化过程中生成，但Mn(Ⅱ)与O2·-（由X/XO系统生成）之间的相互作用却不能产生HO·，且不会生成Mn(Ⅲ)。然而，我们发现只有在肼类化合物共存时，Mn(Ⅱ)和O2·-才能生成·OH，同时还形成以N为中心的自由基。利用FAM标记的DNA片段，我们进而发现肼类化合物/Mn(Ⅲ)诱导的DNA裂解发生在每个核苷酸的位置，没有明显的位点特异性。综上所述，我们提出肼类化合物/Mn(Ⅲ)生成HO·是由于先生成Mn(Ⅱ)和O2·-，二者之间的相互作用导致了瞬态中间体MnO2·+的形成，MnO2·+可从肼类化合物上夺取H生成氮中心自由基和MnOOH+，随后MnOOH+均裂分解产生HO·。本研究报道了一种依赖于O2·-但不依赖于H2O2的新型HO·产生机制，这对今后肼类化合物和锰的研究具有广泛而重要的化学、生物医学和毒理学意义。<br>　　锰催化氧化乙酰肼的分子机制:氮中心自由基和乙酰碳自由基的检测和确认<br>　　作为异烟肼(INH)的代谢产物，研究认为乙酰肼(AcHZ)是INH治疗后引起严重肝毒性和潜在致死性肝损伤的主要原因。AcHZ被代谢激活产生的活性自由基可以共价结合体内关键蛋白质。但是，代谢激活AcHZ过程中产生的活性自由基种类仍不清楚。本研究综合采用ESR自旋捕获/HPLC/MS方法以及TEMPO捕获法，在酶（如髓过氧物酶/H2O2）和金属离子(如Mn(Ⅲ)和Cu(Ⅱ0)催化氧化AcHZ过程中检测并确认了氮中心自由基和乙酰碳自由基的生成。采用15N同位素标记法进一步确定了氮中心自由基的准确位置位于肼基的末端氮原子。本研究首次确认AcHZ催化氧化过程中产生的乙酰碳自由基、氮自由基及其准确位置。该发现为探讨AcHZ的肝毒性效应提供了新的视角。