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摘要目的：<br>　　肾癌又称肾细胞癌(renal cell carcinoma，RCC)，是泌尿系中最常见的恶性肿瘤之一，近二十年来其发病率增速在以每年2％的速率快速增长[1，2]。然而大部分早期肾癌无明显临床症状，约30％的患者初次就诊即发现转移，即使局限性肾癌患者早期接受手术治疗后仍有30％的患者出现远期复发转移[3]。由于肾癌细胞对放、化疗均不敏感，大大限制了转移性肾癌的有效治疗手段。自2005年来首款靶向药物应用于转移性肾癌治疗并取得了良好的疗效，随后以舒尼替尼(Sunitinib)、帕唑帕尼(Pazopanib)、索拉菲尼(Sorafenib)等为代表的酪氨酸激酶抑制剂(Tyrosine kinaseinhibitors，TKI)广泛应用于转移性肾癌的临床治疗[4]。其中舒尼替尼作为一种口服的多靶点抑制剂，具有强大的抑制肿瘤血管生成和直接的抗肿瘤活性作用[5]。临床研究证实其在延长转移性肾癌的无进展生存期(Progression-free survival，PFS)、总生存期(Overall survival，OS)以及提高客观缓解率(Objective response rate，ORR)和疾病控制率(Disease control rate，DCR)等方面均取得了不俗的疗效，并被泌尿外科各大指南推荐为转移性肾癌一线用药[6，7]。然而临床实践发现约有三分之一的患者初始用药便对舒尼替尼耐药，而初始敏感的患者在用药1年左右也相继出现继发耐药现象，这也成为这一类新型药物在晚期肾癌治疗疗效难以获得实质性突破的重要原因[8]。目前肾癌靶向药物耐药的分子机制尚不明确，同时也缺乏有效手段来逆转这一耐药现象。因此通过探索影响肾癌靶向药物治疗耐药的分子基础和机制，并利用有效靶点打破和逆转耐药，实现延长患者生存成为研究的重点。<br>　　环状RNA(Circular RNAs，circRNAs)是一类具有封闭环状结构的小RNA，它由前体mRNA(pre-mRNA)的外显子跳跃或转录物的反向剪接而形成，不易被酶降解，因此在生物体内具有高度稳定性[9]。环状RNA以往被认为是人体内无功能物质，但是随着高通量测序广泛应用，环状RNA被发现在人体各个器官和组织中广泛存在，并发挥着重要的生物功能作用[10,11]。大量研究证明环状RNA参与了肿瘤的发生、发展的重要生理过程，并与肿瘤增殖、侵袭、转移等有着密切关系[12,13]。<br>　　本研究希望通过探索环状RNA在肾癌舒尼替尼药物耐药过程中的相互功能作用，并进一步研究其影响耐药的相关分子机制，为肾癌靶向耐药的基础研究提供新的理论依据。同时通过相关研究寻找逆转肾癌靶向耐药的新靶点以及预测耐药的新型生物分子标志物，为临床治疗提供科学参考。<br>　　方法：<br>　　1.通过舒尼替尼药物体外序贯处理肾癌细胞系，构建肾癌舒尼替尼耐药细胞系，并通过CCK-8（Cell Counting Kit-8）增殖实验、单细胞克隆形成实验验证耐药细胞系的耐药性。<br>　　2.确认耐药细胞系构建成功后，将耐药细胞与敏感细胞(3∶3)进行全转录组高通量测序，分析两组细胞间转录组表达的差异性及分布特征，并刷选差异表达的环状RNA。<br>　　3.设计环状RNA“背靠背”引物，通过一代测序、琼脂糖凝胶电泳验证引物特异性。挑选表达上调和下调各6条环状RNA，借助实时定量PCR(Quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR)验证测序结果。<br>　　4.挑选目的环状RNA扩大验证样本，在不同肾癌细胞系验证目的环状RNA的表达水平与对应舒尼替尼药物的半抑制浓度(IC50)的相关性。qRT-PCR验证46例临床肾癌组织样本中目的环状RNA与临床药物治疗预后相关性。<br>　　5.确定目的环状RNA为cSLC8A1后，通过放线菌素D抑制实验、RNase R消化实验、荧光原位杂交实验(Fluorescence in situ hybridization，FISH)验证cSLC8A1环状特性及亚细胞分布特征。<br>　　6.通过cSLC8A1的shRNA（short hairpin RNA）敲低慢病毒以及过表达慢病毒构建稳转细胞系，肾癌细胞进行稳转后利用qRT-PCR验证敲低和过表达效率。通过CCK-8增殖实验，单细胞克隆形成实验验证干预后肾癌细胞对舒尼替尼药物反应性。将通过将稳转病毒敲低cSLC8A1表达的肾癌786-O细胞以及对照细胞种植小鼠皮下，成瘤后舒尼替尼药物40mg/kg/天灌药，测量肿瘤大小。<br>　　7.对环状RNA-蛋白下拉实验(Pull-Down)产物进行蛋白质谱分析并结合数据库预测结果，确定cSLC8A1可能结合蛋白FUS，通过RNA免疫共沉淀实验进一步验证cSLC8A1可以与目的蛋白FUS相结合。<br>　　8.通过qRT-PCR实验、Western Blot实验、免疫组化实验分析结合蛋白在耐药与敏感的细胞和组织内FUS的蛋白表达水平及mRNA转录表达水平，分析其与临床预后相关性。通过构建肾癌FUS敲低稳转细胞株，通过CCK-8增殖实验、单细胞克隆形成实验进一步验证FUS与肾癌舒尼替尼耐药中功能作用。<br>　　9.通过蛋白免疫共沉淀实验，以及放线菌酮抑制实验验证cSLC8A1可以调控FUS蛋白稳定性从而发挥功能作用。<br>　　10.验证cSLC8A1与FUS蛋白结合共同发挥功能作用，通过“补救(Rescue)”实验即存在或不存在cSLC8A1条件下敲低或过表达FUS，通过CCK-8增殖实验检测IC50，进一步说明cSLC8A1与FUS蛋白相互作用影响在肾癌细胞的耐药性。<br>　　结果：<br>　　1.成功构建肾癌舒尼替尼786-O和ACHN耐药细胞系，并命名为Sun-7R(786-O sunitinib resistant cell line)和Sun-AR(ACHN sunitinib resistant cell line),实验证明细胞系对舒尼替尼具有耐药性。<br>　　2.高通量测序结果显示在耐药组与敏感组细胞中有广泛表达的环状RNA存在。根据差异变化大于两倍(Flod change≥2)，FDR＜0.05标准，共获得共35个表达显著差异的环状RNA，其中18个表达上调，17个表达下调。<br>　　3.分别挑选耐药组中表达上条的环状RNA cSPECC1、cMPP6、cSLAIN2、cRANBP9、cPHACTR4、cPAPPA2，以及表达下调的环状RNA cSLC8A1、cLPAR1、cMTCL1、cSCLT1、cDCBLD2、cHIPK2，设计特异性引物，在肾癌耐药与敏感细胞系中验证，qRT-PCR结果显示12种环状RNA表达趋势与测序结果。其中上调的cPAPPA2与表达下调的cSLC8A1具有显著差异。<br>　　4.在不同肾癌细胞系以及临床样本验证结果显示cSLC8A1与肾癌舒尼替尼耐药具有相关性，即在耐药组织或细胞中cSLC8A1低表达，且低表达组预后更差。<br>　　5.确定目的环状RNA为cSLC8A1(Circbase数据库中编号hsa_circ_0000994)，该环状RNA由SLC8A1第2外显子反向剪切组成，长度1832bp，其在肾癌组织中具有高丰度表达，且具有环状RNA稳定性特征。细胞亚定位显示cSLC8A1可以广泛存在与细胞质和细胞核中。<br>　　6.对肾癌786-O以及ACHN细胞系稳转cSLC8A1的shRNA慢病毒后，两种细胞表现对舒尼替尼耐药性;对肾癌舒尼替耐药细胞系过表达cSLC8A1后，耐药细胞恢复舒尼替尼敏感性。小鼠体内实验证实敲低cSLC8A1后可以促进肾癌舒尼替尼耐药。<br>　　7.进一步验证cSLC8A1参与肾癌舒尼替尼耐药下游机制，环状RNAPull-Down实验的蛋白质谱分析、数据库预测以及RNA免疫共沉淀结果显示，cSLC8A1可以与RNA结合蛋白FUS结合。<br>　　8.Western Blot及免疫组化实验结果显示FUS蛋白在耐药细胞或组织中高表达，且其相关的mRNA表达水平无差异;FUS蛋白表达与cSLC8A1表达水平成负相关，且肾癌舒尼替尼治疗患者中FUS高表达组患者预后更差。细胞功能实验中敲低肾癌耐药细胞系中FUS后，耐药细胞可以恢复对舒尼替尼敏感性。<br>　　9.进一步研究显示cSLC8A1与FUS蛋白结合促进FUS泛素化，从而加速FUS蛋白降解实现逆转耐药。<br>　　10.“补救”实验结果显示cSLC8A1与FUS蛋白在舒尼替尼耐药的功能调节上具有相互抑制的作用，敲低cSLC8A1可以促进肾癌细胞对舒尼替尼耐药，同时敲低FUS后可以恢复敏感性;过表达FUS后可以促进肾癌细胞对舒尼替尼耐药，同时过表达cSLC8A1后可以逆转其耐药。<br>　　结论：<br>　　在肾癌舒尼替尼耐药过程中存在大量环状RNA并广泛参与其中，特别是cSLC8A1表达差异与耐药关系密切，即耐药细胞和组织中cSLC8A1低表达，临床资料显示低表达cSLC8A1的患者更容易产生舒尼替耐药且预后差，cSLC8A1可以作为预测肾癌舒尼替尼敏感性的一种潜在生物标志物。cSLC8A1与FUS蛋白竞争性结合，促进FUS泛素化而加速蛋白降解，从而实现逆转肾癌舒尼替尼耐药，cSLC8A1有可能成为逆转肾癌舒尼替尼耐药新靶点。