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摘要青少年特发性脊柱侧弯（adolescent idiopathic scoliosis，AIS）是指在青春期开始出现的原因未明的脊柱向侧方弯曲形成角度大于10°并伴有椎体旋转的脊柱三维畸形。流行病学研究显示该发病率约为2％～3％，是一种最常见的脊柱畸形。目前在疾病的诊断方面，AIS属于排除性诊断，需要在排除其他如先天性脊柱侧弯、结缔组织等潜在疾病伴随的脊柱侧弯后方可确诊，缺乏特异性分子标记物对其进行早期筛查;在治疗方面，患者一经确诊需要接受严密的随访以观察角度是否进展。对于进展性的脊柱侧弯，随访可以评估角度的进展程度以及确定是否需要佩戴支具治疗或接受侵入性的手术治疗;而对于非进展性的脊柱侧弯患者，随访期间行脊柱摄片仍要接受大量的辐射，目前亦缺乏有效的手段或分子标记物预测患者的角度是否会进展。因此，对AIS发病和角度进展机制的深入研究有助于更好的服务于临床的治疗，减少患者的痛苦和费用。<br>　　基于家系和双胞胎的研究提示遗传学因素在AIS的发病中发挥不可忽视的作用。随着二代测序技术(next-generation sequencing，NGS)的发展，研究人员利用全基因组关联分析(genome wide association studies，GWAS)和全外显子测序(whole-exome sequencing，WES)研究在不同的AIS种族群体中亦发现了一些与AIS发病或疾病严重程度相关的基因多态性或罕见突变。到目前为止，已经确定了20多个基因的易感位点或常见突变与AIS相关。尽管如此，仍没有一个基因能解释AIS的全部病理生理机制。且遗传学研究中出现的一些问题（如尽管存在家族性发病，但大多数患者呈现散发病例的特点、一些候选基因在表现为常染色体显性遗传特征的部分家系中外显不全等）尚未得到合理的解释，提示需要从新的遗传学角度去审视AIS发生的遗传背景。<br>　　寡基因遗传(oligogenic inheritance)是指疾病或性状的发生由几个基因同时变化导致。有研究提示男性AIS患者可能需要携带更多的基因突变才会发病，且更有可能将疾病遗传给下一代和或有同时患AIS的兄弟姐妹。另有一项研究发现AIS患者的一级亲属患病的机率为15.8％，二级、三级亲属的患病机率则分别为2.4％和1.4％。这一现象也支持AIS的发生是由多个基因同时参与的，因为亲属关系越近，遗传到的基因突变数量也会越多。最近的一项全外显子测序分析研究则显示部分AIS患者携带一些细胞外基质相关基因的突变，且携带基因突变的数量与患者的部分表型相关。因此，我们认为寡基因遗传可能是部分AIS患者的遗传模式。<br>　　目的：<br>　　研究中国汉族AIS患者新的易感基因，和寡基因遗传模式的比例及特点。通过研究AIS相关基因之间的相互作用，有助于对AIS发病机制以及寡基因遗传本质的理解。通过研究基因突变负荷与角度进展等临床特征的相关性，有助于为AIS的早期诊断和临床干预选择提供线索。<br>　　方法：<br>　　1.收集40个中国汉族AIS三人小家系(Trios)的血液样本并进行全外显子测序。将文献报道的AIS致病基因及在基因工程动物模型中（包括小鼠和斑马鱼模型）能导致脊柱侧凸的基因整理归纳为AIS相关基因，在外显子数据中筛选上述基因的罕见-功能破坏性突变，研究在小家系中寡基因遗传模式出现的比例;<br>　　2.纳入183例散发AIS患者和153例对照人群，对其进行全外显子测序，分析AIS相关基因的寡基因遗传模式在两组人群中出现的频率是否存在差异;<br>　　3.提取千人基因组计划数据库中中国汉族人群的外显子数据（222例），更全面的分析AIS相关基因的罕见-功能破坏性突变及寡基因遗传模式在中国人群中出现的频率;<br>　　4.采用单变量和多变量Cox回归分析携带罕见-功能破坏性突变数量、初次就诊角度大小等参数与角度进展之间的关系，探究寡基因遗传是否能用于预测AIS患者角度的进展;<br>　　5.利用上述全外显子组测序数据进行基因负荷试验(Gene-based burden test)研究在汉族AIS患者发病中起重要作用的易感基因，同时进一步验证在基因工程动物模型中发现的候选基因在AIS发病机制中的作用;<br>　　6.研究AIS相关基因相互作用组(interactome)中的基因其突变在患者和对照人群中出现的频率是否存在显著性差异，以更深入的研究AIS的寡基因遗传特性;<br>　　7.通过细胞免疫荧光实验研究AIS相关的FLNB基因突变对其蛋白定位、与Flna蛋白相互作用、及对胞内肌动蛋白张力丝形成的影响;<br>　　8.在双胞胎家系中，采用计算机蛋白结构分析与同源模建评估基因突变对Flnb蛋白结构的影响;采用免疫共沉淀实验研究基因突变对Flnb和Ofdl蛋白相互作用的影响;<br>　　9.在三人小家系22和27中，采用计算机蛋白结构分析与同源模建评估基因突变对Flnb蛋白结构的影响;采用免疫共沉淀实验研究基因突变对Flnb和Ttc26蛋白相互作用的影响。<br>　　结果：<br>　　1.在40个AIS三人小家系中，42.5％（17/40）的患者携带AIS相关基因的突变，在8个小家系中，患者携带≥2个AIS相关基因的罕见-功能破坏性突变，即有20％(8/40)的小家系符合寡基因遗传的模式，且有5个家系中患者携带FLNB基因的突变;<br>　　2.综合AIS患者的数据，发现33.93％的患者携带大于等于2个AIS相关基因的罕见-功能破坏性突变（即寡基因遗传），较对照人群显著性升高(37/186versus3/150，odds ratio[OR],9.946;95％confidence interval[CI],3.008-32.893;p=2.00E-06);<br>　　3.寡基因遗传出现的频率AIS患者较千人基因组计划来源的对照亦显著升高(37/186versus8/214,OR=5.321;95％CI=2.417-11.714;p=6.00E-06);<br>　　4.单变量生存分析显示初次就诊角度大小(＞23vs.≤23，p=2.00E-03，hazard ratio[HR]，2.137，95％CI=1.324-3.448)和携带罕见-功能破坏性突变数量(＞=2vs.0or1，p=7.69E-11，HR=5.098，95％CI=3.121-8.328)具有预后价值;多变量分析提示初次就诊角度大小(＞23vs.≤23，p=2.50E-02，HR=1.781，95％CI=1.074-2.955)和携带罕见-功能破坏性突变数量（＞=2vs.0or1，p=3.29E-07，HR=4.304，95％CI=2.458-7.537）可能为影响角度进展的独立的预后因素;<br>　　5.在基因负荷试验分析中，FLNB(p=6.30E-05)，TTC26(p=3.07E-04)，PTK7(p=5.37E-03),CNTNAP(p=7.12E-03),FBN1(p=7.12E-03)和TTLL3(p=2.33E-02)基因的罕见-功能破坏性突变在AIS患者中显著富集;<br>　　6.11.21％(25/223)的AIS患者携带FLNB基因的罕见-功能破坏性突变，其中64％(16/25)的患者还携带有其他AIS相关基因的罕见-功能破坏性突变（如TTC26,PTK7,TTLL3，OFD1等基因）;<br>　　7.FLNA基因的罕见-功能破坏性突变在AIS患者中出现的频率较对照组显著升高(p=2.58E-03,OR=1.781,95％CI=1.074-2.955);<br>　　8.部分FLNB基因突变(FLNB.p.M1803L、p.S2503G、p.T2166M)导致蛋白在细胞核周围异常聚集;部分突变(FLNB.p.R566L、p.A2282T、p.S2503G、p.R199Q、p.R2003H)导致纤维型肌动蛋白在胞内部分区域聚集，形成肌动蛋白张力丝;<br>　　9.在双胞胎家系中，突变型(R2003H)FLNB蛋白结构中，H2003侧链能与E2078形成新的较强的氢键相互作用;免疫共沉淀实验提示两个基因同时发生突变(FLNB，p.R2003H，OFD1，p.Y437F)时，两蛋白的相互作用显著性减弱;<br>　　10.在三人小家系22和27中，突变型(A2282T)FLNB蛋白结构中，T2282的侧链间可以形成分子间氢键，而突变型(R566L)FLNB蛋白结构中，L566没有与周围任何氨基酸形成氢键;免疫共沉淀实验提示两个基因同时发生突变(FLNB，p.R566L，TTC26,p.R297C;FLNB，p.A2282T，TTC26,p.R50C)时，可增强两蛋白的相互作用。<br>　　结论：<br>　　通过以上研究，发现约1/3的AIS患者呈寡基因遗传模式，更为重要的是，携带罕见-功能破坏性基因突变的数量是影响角度进展的独立的预后因素，提示在AIS的发病中，更多的遗传突变负荷会导致更严重的脊柱表型。<br>　　另外，发现FLNB可能为AIS—新的易感基因。值得注意的是，携带FLNB基因突变的患者中，约2/3的患者同时携带有其他AIS相关基因的突变。基于家系的机制研究中，两个AIS相关基因同时发生突变可影响两蛋白的相互作用，提示FLNB与其他基因的相互作用在AIS的发病机制中发挥重要的作用。